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目的:研究2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus, T2DM)合并非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)个体的炎性因子及肝脏中IKKε的表达及意义,从而在分子水平上证实IKKε在T2DM合并NAFLD中的表达,并进一步推断其参与免疫炎症反应的机制,为今后研发肥胖、糖尿病等方面的新药打下基础。 方法:60只雄性SD大鼠随机分为对照组和模型组,模型组再分为T2DM组、NAFLD组、T2DM合并NAFLD组。用高糖高脂饮食诱导后腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的方法复制2型糖尿病模型。采用改良高糖高脂饮食喂养复制非酒精性脂肪肝模型。以注射链脲佐菌素48小时后随机血糖大于16.7mmol/L并维持一周作为2型糖尿病成模标准。肝脏组织活检光镜下见大鼠肝细胞内弥漫大量的脂肪空泡作为非酒精性脂肪肝成模标准。每周测量大鼠体重,实验结束时,测定空腹血糖(fasting blood gulcose,FBG),主动脉取血,称量肝脏湿重,计算肝指数,肝脏取材行光镜、电镜观察肝脏病理组织学改变。采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、高敏C反应蛋白(high sensitive C reactive protein, hs-CRP)、甘油三酯(triglyceride, TG)以及总胆固醇(total cholesterol, TC)。采用双抗体放射免疫分析法测定血清空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)。酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法测定血清脂联素(adiponectin, APN)、游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平的变化。采用免疫组化检测IKKε和NF-κB p65在肝脏中的表达情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blotting法检测肝脏组织IKKε的表达。最后利用SPSS19.0软件包对各组数据进行统计学分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。 结果:(1)肉眼观及光镜检查对照组:肉眼观,正常对照组大鼠肝脏形态大小正常,边缘锐利。光镜下,肝细胞胞核大而圆,居中央,胞浆丰富,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。T2DM组:肉眼观,2型糖尿病组肝脏稍饱满,边缘稍圆钝,质地稍脆。光镜下,肝小叶结构基本完整清晰,肝细胞浊肿明显,部分肝细胞体积增大。NAFLD组、T2DM合并NAFLD组:肉眼观,肝脏增大明显,边缘钝,质软脆,色发黄,部分肝脏表面呈花斑状改变,触之有油腻感。光镜下,可见弥漫性肝细胞脂肪空泡变性,肝细胞肿胀明显,细胞核被挤到一侧。(2)电镜检查对照组:肝细胞胞核呈圆形,胞浆内无明显脂滴形成,胞浆内线粒体丰富。T2DM组:肝细胞内线粒体数量减少,胞浆内偶见脂滴形成。NAFLD组、T2DM合并NAFLD组:肝细胞内出现大量脂滴聚集,有互相融合现象,线粒体体积增大,出现多形性线粒体。(3)炎性因子检测:与对照组比较各模型组血清APN含量均降低,FFA及hs-CRP含量均显著升高(P<0.01)。模型组之间相比较,T2DM合并NAFLD组的APN、FFA、hs-CRP表达均高于T2DM组及NAFLD组(P<0.05)。(4)免疫组化检测:IKKε和NF-κB p65在对照组中几乎不表达,在模型组中呈高表达,其表达阳性程度以T2DM组、NAFLD组、T2DM合并NAFLD组逐渐升高。IKKε主要定位于胞浆中,胞浆呈黄褐色。NF-κB p65主要定位于胞浆(和/或胞核)中,阳性表达呈黄褐色。各组之间表达差异有统计学意义(P<0.01)。(5)RT-PCR和Western blot检测各组肝脏组织IKKε的表达:模型组表达量均高于正常对照组,模型组中,T2DM合并NAFLD组IKKε的表达量最高,其次为NAFLD组,T2DM组表达量最低。各组表达量有统计学差异(P<0.01)。(6)IKKε与NF-κB p65的相关性分析:经等级相关分析,IKKε与NF-κB p65之间存在高度相关性(r=0.969,P=0.000)。 结论:(1)在2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病的发生及发展过程中,血清APN、FFA、hs-CRP的水平可以反映其进展。(2)IKKε可能参与了2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病的发生发展过程。(3)IKKε可能通过NF-κB通路发挥作用,通过干预IKKε的作用发挥,可能延缓病变进展。