目的:稀土元素（rare earth elements,REEs）是元素周期表中17种特殊元素的统称,包括15个镧系元素（Lanthanide）以及与其电子结构和化学性质相近的钪（Sc）和钇（Y）。镧（Lanthanum,La）,作为轻稀土元素的代表,具有稀土元素独特的理化性质,通常作为研究REEs生物学作用的代表物质。研究显示REEs能够通过皮肤、口、呼吸道等多种途径进入机体并在组织器官中蓄积,造成机体损伤和功能异常。中国的流行病学调查显示,高稀土地区儿童的平均智商和记忆能力显著低于低稀土地区儿童。Fan发现稀土矿区7-10岁儿童血液中的稀土含量是对照区儿童的1.73倍,智商得分与家与稀土矿区的距离有关。而将氯化镧（LaCl₃）注入一日龄鸡（day-old chicks）的前脑半球中心可抑制记忆的恢复,口服摄入LaCl₃可造成小鼠的神经行为异常。Feng发现LaCl₃暴露可阻碍中枢神经系统发育,干扰脑中微量元素分布和神经递质水平,损害学习和记忆能力。我们之前的研究显示,LaCl₃可以通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路、[Ca²⁺]_i/CaM/CaMKⅣ/CREB信号通路和NF-κB信号通路影响记忆相关蛋白的转录与表达。还可通过干扰Glu-Gln循环,异常增加谷氨酸、D-丝氨酸水平,过度激活海马NMDA受体,诱发兴奋性毒性,并可经由线粒体途径引起神经细胞过度凋亡。尽管如此,有关镧的神经毒作用机制仍未完全阐明,需做进一步的研究。自噬是一种广泛存在于真核细胞中的溶酶体依赖型降解途径,可将存在于细胞质中的异常蛋白质和受损细胞器等及时消除,并为细胞修复和重建提供能量与原料,是细胞面对有害应激的自我平衡和存活机制。然而,自噬水平的过度增强或抑制则会对机体产生不利影响。自噬受到几条以mTORC1为中心的信号通路调控。其中最具代表性的是I型PI3K/AKT信号通路和AMPK信号通路。I型PI3K/AKT是自噬主要的负向调控信号。在自噬发生过程中,I型PI3K能够磷酸化底物PIP2生成PIP3,PIP3作为第二信使与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合,促使Akt蛋白的苏氨酸Thr308和丝氨酸Ser473位点被磷酸化而激活,活化的Akt通过抑制TSC1和2的活性,间接激活位于其下游的mTORC1并抑制自噬。AMPK信号通路为自噬的正向调控信号。与AKT的作用相反,AMPK通过激活TSC 1/2复合物来抑制Rheb和mTORC 1的活化,从而启动自噬。已有的研究结果显示,LaCl₃暴露可导致大鼠海马组织与原代培养神经元、原代培养星形胶质细胞中的活性氧（ROS）均明显增多,而我们最近的一项研究结果表明,LaCl₃暴露引起过量产生的ROS可通过激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路,分别在细胞核和细胞质磷酸化c-Jun和FoxO1/3影响自噬相关基因Atg4、BECN1（Atg6）、Map1lc3b（Atg8）的转录,提示LaCl₃可能通过影响大鼠海马神经细胞自噬水平进而影响其正常生理功能。基于之前的研究结果本次研究采用整体动物与体外细胞培养相结合的方法,应用神经行为学与分子生物学等技术手段,从镧对自噬水平的变化变化及相关调控信号通路AKT/mTOR、AMPK的活化状态变化等方面进行研究,为揭示镧的神经毒作用机制提供新的线索。研究方法:整体动物试验,采用健康成年的SPF级Wistar大鼠96只（雄性48只,体重240±10g;雌性48只,体重220±10g）。在动物室饲养大鼠5天以适应周围环境。将雌性大鼠随机分为四组（每组12只）,然后雌性和雄性以1:1的比例合笼交配,次日发现阴栓者记为妊娠第0天。在妊娠期（3周）和哺乳期（3周）期间,各组母鼠分别暴露于含0,0.25%,0.5%,1.0%LaCl₃的水溶液。断乳后,各组仔鼠自行饮水摄取相应浓度的LaCl₃水溶液,至断乳后1个月结束,进行行为学试验。采用Morris水迷宫试验对大鼠进行空间学习记忆能力的训练和测试,采用Realtime PCR法和Western Blot法检测仔鼠海马神经细胞内LC3B、p62、Beclin1、Bcl-2、p-Bcl-2、Lamp2a、III型PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、TFEB的mRNA和蛋白水平。采用透射电镜的方法检测细胞内自噬体。体外试验使用出生24 h内的仔鼠进行大脑神经元的原代培养。采用神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元。采用免疫荧光法检测神经元内LC3B和p62的蛋白表达水平和共定位。采用Realtime PCR法和Western Blot法检测原代培养神经元内LC3B、p62、Beclin1、Bcl-2、p-Bcl-2、Lamp2a、III型PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、TFEB的mRNA转录和蛋白表达水平。采用自噬干预剂Wortmannin和Baf-A1干预后对自噬相关蛋白指标再次测定,避免出现假阳性结果。最后采用透射电镜的方法检测原代培养神经元内自噬体。再次验证镧能导致自噬异常升高的结论。结果:1、LaCl₃对子代大鼠学习记忆能力的影响。Morris水迷宫训练前5天,染镧组仔鼠的学习能力明显弱于对照组。定位航行试验中,仔鼠找到平台的逃避潜伏期和游泳距离随着染镧剂量增加而逐渐增加,游泳轨迹显示,染镧组仔鼠寻找平台的路径杂乱无章,游泳距离增加。空间探索试验中,染镧组仔鼠进入目标象限次数、在目标象限停留时间和游泳距离均随着染镧剂量的增加而降低,轨迹热图显示,染镧组仔鼠游泳轨迹杂乱,并没有明确的探索策略,甚至很少进入目标象限。2、LaCl₃对自噬水平及自噬相关信号通路AKT/mTOR和AMPK表达水平的影响。随着染镧剂量的增加,AKT/mTOR信号通路受到抑制,AMPK信号通路被激活,自噬水平明显上升。3、LaCl₃对仔鼠海马神经细胞超微结构的影响。对照组仔鼠海马神经元胞体大而圆润,胞质内的细胞器丰富且清晰可见,有非常丰富、结构正常的内质网、高尔基体和线粒体。细胞核清晰,核仁核膜光滑完整。胞质内无双层膜空泡样结构。1.0%LaCl₃组中,神经元结构发生改变,胞体形状不规则,胞质内可见内质网和高尔基体,线粒体明显减少,且胞质内出现大量双层膜空泡样结构,内有包含物,符合自噬体的结构特征。核膜形状发生改变,无法观察到核仁,说明LaCl₃对海马神经细胞具有较强的损伤作用。4、LaCl₃对原代培养神经元超微结构的影响。对照组神经元完整,胞体大而圆润,细胞核大而完整,胞质中可见少量空泡样结构。使用Wortmannin抑制后的神经元细胞核大而圆润,胞质内可见少量细胞器,无其它异常结构。使用Baf-A1抑制自噬后,神经元内出现大量含有内容物的双层膜空泡样结构,应为无法融合的自噬体,胞质内出现大量线粒体,细胞核较小,且核膜边缘模糊。在镧暴露之后,神经元中出现大量双层膜空泡样结构,且空泡中内含物较多,具有自噬体的特征,说明镧能诱导原代培养神经元发生自噬。加入了自噬上游抑制剂Wortmannin后神经元中几乎没有异常结构,并没有自噬体的存在,说明抑制剂从上游抑制了自噬。镧暴露的同时加入了自噬体融合抑制剂Baf-A1,结果显示加入Baf-A1的神经元中出现了大量的双层膜空泡样结构,且数量多于单独镧暴露的神经元,说明抑制了自噬体融合后,自噬体滞留在细胞内,大量堆积。结论:1、LaCl₃可导致子代大鼠空间学习记忆能力损伤。2、LaCl₃可抑制子代大鼠AKT/mTOR信号通路,活化AMPK相关信号通路和TFEB,导致自噬水平升高。3、LaCl₃可导致子代大鼠神经细胞超微结构发生改变,胞质内出现的自噬体数量明显增加。4、LaCl₃可抑制原代大鼠神经元AKT/mTOR信号通路,活化AMPK和TFEB信号通路,并促进Bcl-2的磷酸化,从而导致自噬水平异常升高。5、自噬抑制剂Wortmannin和Baf-A1干预实验以及透射电镜结果可以排除假阳性的干扰,确定镧具有促进神经元自噬的能力。6、镧诱发的神经元自噬异常增强可能是其导致该类细胞受损乃至死亡的重要机制之一。