口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄类动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,对畜牧业的危害极大。整合素是介导FMDV感染的重要受体之一,是否起决定性作用及其机制尚不清楚。本文制备了抗牛整合素β6亚基的多抗、建立了稳定表达β6亚基的细胞系、并检测了整合素β6亚基在不同组织中的表达谱,为深入探讨β6亚基在FMDV感染中的作用研究奠定了基础。其具体研究结果如下:1.牛整合素β6亚基基因的原核表达、纯化及多抗的制备从牛甲状腺组织中提取总RNA,根据GenBank中已发表的牛的β6亚基基因序列,设计并合成引物P1和P2,利用RT-PCR扩增得到β6基因全长,将其亚克隆到pEASY-T3载体上,并进行测序。序列分析表明:与已发表β6基因序列有99%的同源性。以β6重组pEASY-T3质粒为模板,以P3和P4为引物,扩增β6胞外域,将其重组到原核表达载体pET32a中,转化BL21(DE3)宿主菌,筛选阳性克隆,提取质粒经酶切、PCR鉴定以及序列分析后,确认获得了β6胞外域重组原核表达质粒pET32a-β6。用IPTG诱导β6胞外域融合蛋白的表达,所表达的目的蛋白大部分以包涵体形式存在,其分子量大小为94Kd左右,与预期的大小相吻合。应用Ni-NTAbeads纯化目的蛋白后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。利用该抗体作为一抗,通过Western Blot检测稳定表达β6亚基的PK15细胞系,检测到了β6蛋白,具有较高的特异性。该研究所获得的多抗及其Western Blot方法为深入研究β6亚基的功能提供了技术手段。2.牛整合素β6亚基基因的真核表达及稳定细胞系的建立设计并合成了β6亚基真核表达引物P5和P6,以pEASY-T3-β6重组质粒为模板,以P5和P6为引物,进行PCR扩增得到β6基因全长,通过BglП和NotI酶切后回收目的片段,连接到FG9载体上,构建了真核表达载体FG9-β6,经序列分析比对正确后,将其转染293T细胞进行瞬时表达,利用Western blot检测β6蛋白表达情况。瞬时表达成功后,将重组质粒FG9-β6转染口蹄疫非敏感细胞株猪肾PK15细胞系,经流式细胞分选GFP阳性细胞系。Western Blot验证GFP阳性猪肾细胞系可稳定表达β6基因。该细胞系的建立为后续利用FMDV感染实验评估β6亚基是否是FMDV感染所必须的受体亚基的研究奠定了基础。3.牛整合素β6亚基mRNA在不同组织中的表达水平本实验建立了检测牛整合素β6亚基mRNA表达的实时荧光定量PCR方法。结果表明,β6在牛体10种组织中有不同程度的表达,其中在肾和舌中表达量较高,其次是心,甲状腺,舌,脾,肺,趾间;肝,肠,气管,睾丸中表达量极低。β6在牛体内高表达的组织基本上是FMDV敏感的组织,表明β6在FMDV自然感染中可能发挥着重要作用。