研究背景急性肺损伤(ALI)是脓毒症最常见的合并症之一,其严重可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS),需要呼吸机辅助治疗。尽管重症医学进展迅速,但ALI/ARDS仍治疗困难、死亡率高、医疗花费巨大。除此之外,研究发现脓毒症所致急性肺损伤会导致ARDS相关肺纤维化,对患者的远期预后及生存质量也造成较大影响。脓毒症造成急性肺损伤的关键是失控的“炎症风暴”,而免疫系统在“炎性风暴”中扮演了极其重要的作用。肠道微生物作为哺乳动物体内“第二大基因库”近年来被发现与众多疾病相关。微生物组不但对胃肠道局部健康发挥重要作用,对全身免疫可能有更大的影响。我们先前临床研究发现补充益生菌可以降低重症监护室呼吸机相关性肺炎的发生,与改善菌群移位相关。Fay等研究发现肠道微生物组可以调节脓毒症小鼠的CD4+淋巴细胞,调节细胞免疫并提高其生存率。然而,益生菌是否可调节全身免疫功能从而减脓毒症急性肺损伤以及其信号通路尚缺乏相关研究。研究目的1.研究益生菌(枯草芽孢杆菌屎肠球菌二联活菌)对CLP诱导的脓毒症小鼠的生存保护效应。2.研究益生菌对脓毒症小鼠肺损伤的影响,探究保护机制。3.研究益生菌对脓毒症小鼠免疫系统的影响,包括先天免疫系统及调节T淋巴细胞(Treg)的影响。4.研究益生菌在脓毒症小鼠巨噬细胞活化、极化中的影响,研究生长素释放激素受体(GHSR)信号通路在巨噬细胞活化、极化中的作用。5.研究巨噬细胞GHSR通路在脓毒症急性肺损伤中的作用。研究方法1.使用益生菌——枯草芽孢杆菌屎肠球菌二联活菌(LCBE)生理盐水溶液以400mg/kg/200ul灌胃预处理一周,之后将小鼠分为2组:假手术组、CLP脓毒症-益生菌组,同等剂量生理盐水灌胃小鼠为盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症组,进行CLP手术模拟小鼠脓毒症。CLP手术组需开腹分离盲肠并结扎穿孔,假手术对照组只需开腹分离盲肠,不做任何处理后回纳并关闭腹腔。手术后常规给予液体复苏治疗,并观察、绘制小鼠7天生存曲线,通过生存分析以检验益生菌对CLP脓毒症小鼠生存率的影响。2.在CLP术后24h,处死小鼠并收集血液、腹腔灌洗液、肺泡灌洗液(BALF)并收集肺脏组织及脾脏组织。测定BALF细胞计数、细胞分类以及总蛋白浓度、肿瘤坏死因子(TNF-α)评估肺损伤。肺组织测定肺湿干重比、制作切片HE染色并根据相应评分表计算肺损伤评分。通过实时荧光定量聚合酶连锁反应(qPCR)测定肺组织中促炎因子(TNF-α、白介素-1 β(IL-1β)、白介素-6(IL-6))、抑炎因子(白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β 1))的表达,研究益生菌对肺部促炎反应及抗炎反应的影响。同通qPCR测定巨噬细胞表面标记物(F4/80)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(M1型巨噬细胞的标记物)和CD206(M2型巨噬细胞的标记物)、淋巴细胞抗原6复合基因座G6D(Ly6G)、结构性表达叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)的表达来研究益生菌对肺部免疫细胞的影响。通过多方面研究益生菌对脓毒症急性肺损伤是否具有缓解作用。3.收集的血液分离后按照说明书通过ELISA测定TNF-α、IL-6、IL-10的水平。分析益生菌对脓毒症全身炎症反应的影响。制作新鲜脾脏单个细胞悬液,应用细胞流式仪检测Treg细胞计数,明确益生菌对小鼠调节T淋巴细胞的影响。4.应用qPCR方法测定小鼠腹腔巨噬细胞的IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、CD38、CD206、GHSR的表达,明确益生菌对先天免疫反应中的重要细胞——巨噬细胞的功能的影响以及是否与GHSR信号通路相关。5.应用转基因小鼠——髓系细胞GHSR基因敲除小鼠(GHSRf/f,Lyz-cre小鼠)研究脓毒症过程中巨噬细胞是否通过GHSR通路减轻肺损伤并减轻脓毒症死亡率。将野生型与转基因小鼠(KO组)分为假手术组与CLP组,分别为WT-Sham、KO-Sham、WT-CLP、KO-CLP组,观察小鼠7天生存率,研究敲除髓系细胞表面GHSR是否可以降低脓毒症小鼠的死亡率。6.野生型与KO组小鼠手术后24小时处死并收集血液、BALF、肺脏、脾脏、骨髓。应用流式细胞仪多重细胞因子测定技术测定血液与BALF中的促炎因子及抑制炎症因子。应用qPCR法测定肺组织中的IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、iNOS、CD206、Ly6G、F4/80、GHSR、Toll 样受体 4(TLR4)、含 NOD、LRR和吡喃结构域的蛋白质3(NLPR3)的基因表达研究敲除髓系细胞表面GHSR对脓毒症肺损伤是否具有保护作用及相关机制。应用WB法测定肺组织中转录因子65(p65)及磷酸化转录因子65(p-p65),AKT及磷酸化AKT以揭示敲除髓系细胞表面的GHSR是否可以通过NF-κ B通路以及AKT通路减轻脓毒症急性肺损伤。7.体外诱导培养野生型及GHSR基因敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),应用脂多糖(LPS)处理 BMDM 细胞,qPCR 法测定 TNF-α、CD38、CD206、GHSR的基因表达,从体外细胞实验进一步验证GHSR信号通路在巨噬细胞极化、活化过程中的作用。8.统计学分析:使用IBM公司SPSS 23.0软件(IBM SPSS,美国)进行统计学分析。生存实验应用Kaplan-Meier生存线及log rank检验。数据表示为平均值±标准差(SD)或四分位数中位数。使用非配对双尾T检验分析显著差异,多组数据之间比较应用单因素方差分析(ANOVA)进行检验。P<0.05认为具有显著的统计学差异。结果1.益生菌对脓毒症小鼠的生存率的影响:CLP脓毒症-益生菌组小鼠生存率显著高于CLP脓毒症组小鼠,益生菌能够改善CLP诱导的脓毒症小鼠的预后、提高生存率。2.益生菌对脓毒症血液中炎症因子的影响:与CLP对照组相比,益生菌组小鼠血清中的促炎因子TNF-α、IL-6显著降低,抑炎因子IL-10增高但无统计学差异,表明益生菌可以调节脓毒症小鼠的全身炎症反应、减轻促炎反应。3.益生菌对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响:与假手术组比较脓毒症组小鼠BALF细胞计数、蛋白浓度、IL-6、TNF-α均明显增高;与CLP脓毒症对照组相比,CLP脓毒症-益生菌组均明显降低。肺组织切片HE染色显示,与对照组相比,益生菌组小鼠肺组织肺间隔增厚、炎性细胞浸润均较轻,肺损伤指数显著低于CLP脓毒症组。qPCR结果:益生菌组小鼠肺组织中促炎因子IL-1 β、IL-6、TNF-α基因表达水平显著低于CLP脓毒症组,而抑炎因子IL-10、TGF-β基因表达明显高于CLP脓毒症组;益生菌组与CLP组F4/80表达无明显差异,CD206/iNOS比值益显著高于脓毒症对照组,Ly6G表达显著低于脓毒症对照组、Foxp3表达显著高于脓毒症对照组。这些结果表明,益生菌可以减轻脓毒症小鼠急性肺损伤。在炎症因子方面:益生菌可以减少促炎因子、提高抑炎因子;在炎性细胞反面:益生菌可以减少中性粒细胞肺浸润、调节巨噬细胞M2/M1比例、增加调节T淋巴细胞,综合分析发现益生菌通过多种方式减轻脓毒症急性肺损伤。4.益生菌对脓毒症小鼠脾脏中Treg的影响:CLP脓毒症组与假手术组对比Treg细胞计数略有增高但无显著差异,益生菌组较假手术组及CLP组均显著增高,提示益生菌可以调节Treg细胞。5.益生菌对小鼠腹腔巨噬细胞的影响:益生菌组小鼠巨噬细胞IL-1 β、IL-6、TNF-α表达均显著低于脓毒症对照组小鼠,IL-10、TGF-β表达高于对照组,TGF-β具有显著差异,CD206/CD38基因表达比值显著高于脓毒症对照组,益生菌组GHSR表达明显低于假手术组及对照组。提示益生菌可以调节巨噬细胞极化与活化,与GHSR信号通路相关。6.GHSRf/f,Lyz-cre小鼠实验结果:KO-CLP组小鼠生存率显著高于WT-CLP组;KO-CLP组小鼠BALF细胞计数、蛋白浓度、TNF-α、IL-6均低于WT-CLP组;肺组织病理提示KO-CLP组小鼠肺损伤显著轻于WT-CLP组;qPCR分析KO-CLP组小鼠肺组织 IL-1 β、TNF-α、iNOS、TREM1、TLR4、IRS2、NLRP3、caspase11、GHSR、Ly6G、AKT1、AKT2 基因表达显著低于 WT-CLP 组,IL-10、TGF-β 显著高于WT-CLP组,KO-CLP组F4/8基因表达低于WT-CLP组但无显著差异,KO-CLP组CD206高于WT-CLP组但无显著差异。WB结果显示KO-CLP与WT-CLPp65无明显区别但p-p65减低,总AKT表达无组间差异,但磷酸化AKT在KO-CLP组显著低于WT-CLP组。这些结果表明敲除髓系细胞表面GHSR调节巨噬细胞在脓毒症过程向抗炎型巨噬细胞M2方向极化,可抑制AKT通路、TLR4-NF-kB 通路、NLRP3 通路。7.野生型与转基因小鼠体外BMDM细胞实验结果:GHSR敲除的巨噬细胞在LPS刺激后炎症因子TNF-α、NLRP3表达显著低于野生对照组;M1型巨噬细胞表面的标志-CD38在GHSR敲除小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中表达低于野生型小鼠、M2型巨噬细胞表面的标志-CD206略低于WT-CLP组,但CD206/CD38比值明显高于WT组小鼠。进一步揭示了阻断GHSR信号通路可以促进巨噬细胞像抑制炎症型的M2方向极化、减轻促炎反应与NLRP3炎性小体信号通路相关。结论益生菌可以通过调节肠道微生物组从而调节机体的先天免疫及细胞免疫,从而调节脓毒症的免疫平衡减轻脓毒症急性肺损伤的作用,同时可通过抑制NF-kB通路及AKT通路减轻脓毒症肺损伤。益生菌可抑制小鼠巨噬细胞表面GHSR的表达;转基因小鼠体内外实验研究证实,敲除/抑制巨噬细胞表面GHSR后,巨噬细胞在刺激下抗炎的M2型巨噬细胞方向极化从而调节先天免疫。