羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)是一类水解蛋白或多肽底物C-端Lys 或Arg的金属蛋白酶。当前,羧肽酶B 已广泛应用于蛋白质、多肽的末端修饰,急性胰腺炎及胰腺植皮排斥的血清标记,尤其在胰岛素原活化为胰岛素的过程中,羧肽酶B 是不可缺少的双酶(胰蛋白酶及羧肽酶B)之一。到目前为止,商业途径获得的羧肽酶B 主要从猪胰脏中提取,使得产品价格昂贵,同时也不可避免地混杂有其它蛋白酶,如胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶。本研究的目的就是试图以基因工程的方法生产一种高效价廉的重组CPB产品。本实验通过分析鼠proCPB 的基因序列,比较其密码子的组成与酵母偏爱密码子的差异,在引物设计时采用基因改构及密码子优化的策略,对鼠proCPB基因的5’序列进行了优化。实验时以RT-PCR法从SD鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体后,转入毕赤酵母GS115 细胞,在醇氧化酶1(AOX1)强启动子的作用下,首次实现了鼠羧肽酶原B 蛋白在毕赤酵母中的表达,并在a-因子信号肽的引导下成功地分泌到胞外。通过表达条件的优化,使用BMGY(pH 6.0)培养基,添加0.5%(m/v)的酪蛋白水解物和3 mmol/L的PMSF,于28 ℃培养,每隔12 h补加0.5%(v/v)的甲醇,重组酵母GS115-proCPB 表达的重组蛋白可达500 mg/L 以上,表达的目的蛋白占总蛋白的94%以上。表达产物经过二步疏水、二步离子交换层析及活化后,每升培养基可获得50 mg以上重组CPB 产品,得到的CPB 纯度达95%以上。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB 的比活力可达110 U/mg(CPB 参照品为180 U/mg)。稳定性分析表明:重组表达的CPB 很稳定,在4 ℃条件下保存5 个月后仍未发生降解,酶的活性仅降低10%。