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间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是在体内间质中存在的成体干细胞。在适当的体内或体外条件下,MSCs可以分化成多种细胞类型。皮肤和关节损伤是犬的常发疾病,给犬带来病痛,严重影响犬的生活质量。干细胞治疗作为一种新兴治疗手段在组织再生和损伤组织修复方面表现出良好治疗效果,而MSCs是目前应用最广泛的成体干细胞。为研究MSCs对犬的皮肤创伤和关节损伤的修复作用,本研究开展了以下实验:1.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)生物学特性研究。本实验通过Ficoll密度梯度分离法分离获得BM-MSCs,采用Ⅰ型胶原酶消化法从脐带华通胶中分离获得UC-MSCs,对分离获得的两种细胞进行离体培养和生物学特性的研究。结果发现,BM-MSCs和UC-MSCs的生长特性相似,细胞均呈贴壁生长、形态为长梭形,排列有明显方向性、呈漩涡状或网状、折光性强,传至第9代仍保持良好的生长活性,群体倍增时间随细胞传代次数增加而增加;BM-MSCs分化能力随传代次数增加而减弱。两种细胞均可诱导分化成成脂细胞和成骨细胞。经免疫荧光染色鉴定,两种细胞表面均表达CD44蛋白,但不表达CD34蛋白。以上结果提示,本实验分离培养的细胞符合MSCs的生物学特性。2.BM-MSCs对犬皮肤创伤的修复作用。本实验通过在4只犬臀部两侧分别做3 cm×3 cm的正方形皮肤创口,右侧作为实验组,在创口制作后的第1、3d,在创口皮下注射1ml异体犬BM-MSCs细胞悬液(1×10~5个细胞/ml);左侧作为对照组在创口皮下注射等量的间充质干细胞培养基,动态观察创面愈合情况。结果发现,犬BM-MSCs治疗的实验组在1w内淡黄色炎性物质减少,创口肉芽组织形成速度快,细胞治疗组的伤口恢复状况比对照组好,细胞治疗组的伤口愈合后较光滑平整。比较第8d和第12d的伤口愈合面积和愈合速度,干细胞治疗组优于对照组。结果提示,BM-MSCs对伤口的炎症反应有抑制作用,对皮肤创伤修复有促进作用。3.本实验通过设立空白对照组、完全培养基对照组、生理盐水对照组、MSCs组及外泌体(exosomes,EXO)组,采用transwell共培养法研究骨髓、脂肪和脐带来源MSCs对关节软骨细胞(articular chondrocyte,AC)的影响,结果发现,三种来源MSCs均能显著增强AC的细胞活性(P<0.01),其中UC-MSCs的作用最强。进一步研究UC-MSCs来源的EXO及其不含外泌体的条件培养基(conditioned medium,CM)对AC增殖的影响,结果发现UC-MSCs不含外泌体的CM和UC-MSC-EXO均能促进AC增殖(P<0.01),但不含外泌体的CM效果更好,提示UC-MSCs主要通过旁分泌方式促进AC的增殖,从而促进关节损伤的修复。4.UC-MSCs对犬膝关节损伤的修复作用。本实验在8只犬身上通过手术打磨膝关节软骨建立关节损伤模型,然后随机将其分成治疗组和模型组。造模后第1和第3d将异体UC-MSCs悬液(1×10~6个/ml)注入治疗组犬的膝关节腔内,模型组注射等量生理盐水。在治疗后3、7、14和28d通过对犬膝关节结构进行活体影像学观察,同时检测犬的体温、血常规、生化指标和炎性因子等指标,并通过扫描电镜和组织学方法观察治疗组与模型组的软骨和髌骨表面的恢复情况。核磁共振、B超和X线检查发现,随治疗时间的增加,干细胞治疗组犬的关节积液不断减少,炎症反应减轻,髌骨腹侧骨皮质锯齿状缺损逐渐好转,髌骨腹侧与滑车脊低密度间隙逐渐增加,软骨逐渐新生,且关节周边受损伤的皮肤筋膜及肌肉组织有所改善和恢复,而模型组的关节积液在14d时仍在增加,炎症反应未见减轻,髌骨和软骨的恢复速度慢。扫描电镜观察发现,治疗组新生软骨组织比模型组的多,可见突起状的新生组织和排列不规则的新生组织纤维,而模型组的软骨可见许多空泡,未见胶原纤维束;治疗组犬的新生软骨组织厚度显著高于模型组(P<0.01)。模型组犬体温在试验开始后的前11d高于治疗组,并在第5、6、10d时有显著差异(P<0.05);在试验后第14d,模型组的白细胞总数和中性粒细胞数均显著高于治疗组(P<0.05),而淋巴细胞数量则显著低于治疗组(P?0.05);在试验7-14d期间,模型组血液中的IL-6、IL-7和TNF-α含量均显著高于治疗组(P<0.05),治疗14d时,模型组与治疗组的IL-6有极显著差异(P?0.01);模型组血液中ALP在7d时极显著高于治疗组,其他生化指标两组间无显著差异。以上结果表明:犬UC-MSCs可能通过促进AC增殖来促进骨关节炎损伤软骨与髌骨的修复,改善关节周边组织状况;UC-MSCs能显著抑制关节损伤的炎症反应,其机制可能是通过抑制白细胞、中性粒细胞和炎性因子的产生来减轻机体发热和炎症反应,同时通过促进机体淋巴细胞和红细胞的产生来增强机体免疫能力和抗感染的能力,通过增加血小板的产生促进血液凝固和伤口愈合。