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鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)是危害雏鸭的一种急性、高致死性传染病,主要侵害3周龄以内雏鸭,严重威胁养鸭业的健康发展。近年来,随着养鸭业不断向产业化、集约化和规模化方向发展,血清学上不同于鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)的报道逐渐增多,鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)已在国内许多地区广泛流行,传统的鸭肝炎的主动免疫或被动免疫失败现象频繁发生,对鸭肝炎的防控提出了新的挑战。VP1基因和VP3基因是鸭甲肝病毒的主要抗原基因。本试验主要将鸭甲肝病毒1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中进行表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。将扩增的DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1基因克隆到p ET-32a(+)原核表达载体中,获得重组表达质粒p ET-1VP3-3VP1。利用IPT G诱导表达,对目的蛋白进行Western blot检测,确定其免疫反应性。然后以纯化的重组蛋白为抗原建立了相应的抗体ELISA检测方法,从而为DHAV-1和DHAV-3的快速血清学诊断奠定了一定的基础。本研究主要包括以下三部分内容:1.p ET-1VP3-3VP1重组表达载体的构建提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,利用设计的2对特异性引物分别进行RT-PCR扩增,得到714bp的1VP3基因和720bp的3VP1基因,将纯化的1VP3和3VP1基因分别克隆至p MD18-T载体中,构建1VP3-3VP1基因克隆重组质粒,然后依次将1VP3-3VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,筛选获得含1VP3和3VP1基因正向插入的、有正确读码框的重组质粒p ET-1VP3-3VP1。用Bam H I和Xho I进行双酶切鉴定,经琼脂糖凝胶电泳检测出两条条带,分别在5900bp和1434bp左右,与预期大小相符。2.pET-1VP3-3VP1的原核表达对获得重组表达载体pET-1VP3-3VP1菌液,进行IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果发现,DHAV-1VP3-3VP1蛋白在大肠杆菌中可稳定、高效地表达。将表达的重组蛋白纯化后只有一条74.1k Da的蛋白条带,与未纯化前的重组表达产物条带的大小一致。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。3.检测DHAV-1和DHAV-3抗体的间接ELISA方法的建立利用纯化的DHAV-1VP3-3VP1蛋白作为包被抗原,分别以抗DHAV-1和DHAV-3的二价阳性血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭Ig G为二抗建立间接ELISA检测方法。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1:200,临界值为OD650值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。对收集的22份DHAV-1和DHAV-3二价阳性血清进行检测,并进行相关性分析,相关系数>0.9,表明建立的计算血清样品单一稀释度ET值的标准直线方程具有较好的参考性。用该方法和中和试验分别检测DHAV-1和DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.77%,初步临床应用结果表明本试验以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长规律的检测。