研究背景与目的:严重脓毒症是ICU患者的主要的原因,细菌、毒素、病毒等均可诱导脓毒症发病,其中革兰阴性(G-)菌及其内毒素在脓毒症发病中的作用与机制已进行了广泛和深入的研究。然而临床资料表明,革兰阳性(G+)菌也是导致ICU内严重脓毒症的主要致病菌之一,且金黄色葡萄球菌感染的发病率和耐药性有逐年上升趋势。面对ICU金葡菌感染高发、高病死率的趋势,寻求有效的应对手段已然是当务之急。目前Treg细胞在以CLP造成腹腔感染或LPS诱导脓毒症发病机制中的作用已得到充分肯定,而其与G+球菌/金葡菌感染发病的关系几无阐述。因此,研究Treg在金葡菌脓毒症发病中的调控作用并阐明其机制,因此探讨两者的关系及相互影响机制,对临床应用非抗菌素手段调控金葡菌脓毒症有非常积极的意义。我们提出假设:Treg可能通过调控Teff对金葡菌感染免疫发生效应,若能经Treg下调金葡菌感染早期的免疫过度激活,维持免疫稳态,不仅有利于降低脓毒症早期机体损害和病死率,赢得治疗时机,还可能有助于病程中后期发挥Teff功能而清除病原体,降低金葡菌感染的总体病死率。因此,拟以大剂量金葡菌SEB诱导实验动物早期过度的全身性免疫炎症反应,通过增加或阻断动物体内CD4+CD25+Treg的方法,观察Treg对SEB诱导的早期炎症反应强度的影响,并探讨其可能的信号转导调控机制。第一部分金葡菌肠毒素B诱导脓毒症大鼠模型及观察目的通过探索不同剂量SEB引起的早期炎症反应模型,构建一个既能在一定时间内引起严重炎症反应同时并发多器官功能损害又不引起实验动物死亡的剂量,在此基础上,进一步检测该模型外周血炎性介质的变化水平,评估该模型的免疫状态变化,为后续发病机制和治疗途径等研究提供基础。方法1、选择清洁级雄性SD大鼠,体重200~300g,随机分为对照组、低、中、高剂量组各10只,均通过股静脉置管后分别注射生理盐水、SEB15ug/100g、30ug/100g、45ug/100g。2、记录造模后大鼠活动情况、外观变化和48h生存率。3、于6h、12h、24h、48h眼球采血,使用ELISA法测定炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平。4、各组死亡或生存达到48小时处死后立即取肺、肝、肾器官镜检观察形态学变化。5、SPSS 20.0软件进行统计分析对于符合正态分布的计量数据表示为均值±标准差;两组细胞因子分泌情况的比较采用独立样本t检验,以P<0.05具有统计学差异,P<0.01为有明显差异。各组间的生存率采用Kaplan-Meier法和Log-Rank法分析并绘制生存曲线图。结果1、一般情况及生存率观察:造模后24h,对照组和低剂量组大鼠活动正常,中-高剂量组表现出典型的脓毒症症状;48h后对照组、低、中、高剂量组生存率分别是100%,100%,50%,20%。2、炎性因子表达:造模后各时间点,对照组TNF-α、IFN-γ、IL-6无明显变化,均低于低、中、高剂量组表达水平。低、中、高剂量组所测各炎性炎症呈进行性升高趋势,24小时达到高峰,随后出现下降趋势。炎性因子的表达与SEB剂量呈正相关。3、重要脏器光镜下改变:对照组和低剂量组,光镜下肺、肝脏和肾脏无明显改变,中-高剂量组大鼠肺、肝脏和肾脏表现出大量炎性细胞浸润、出血、坏死等改变。结论经股静脉注入金葡菌SEB 30μg/100g剂量能够建立全身炎症反应明显、多器官损害、病程稳定、适合早期研究的大鼠脓毒症模型,48h生存率在60%;SEB剂量和炎症反应水平、多器官损害程度正相关。第二部分Treg活性对金葡菌肠毒素B诱导的脓毒症大鼠的影响目的通过增加或阻断动物体内CD4+CD25+Treg的方法是否能逆转金葡菌肠毒素诱导的早期炎症反应强度的影响,以此来证明调节性T细胞在金葡菌诱导的脓毒症早期过度炎症反应中的作用,并探讨其可能的调控机制。方法1、采用免疫磁珠法提取大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞,检测其活性及流式细胞术行纯度鉴定。2、模型制备:雄性清洁级SD大鼠随机分为SEB组,阻断组(SEB+PC61),Treg组(SEB+Treg),每组10只。各组经股静脉注入金葡菌SEB 30μg/100g剂量,阻断组同时注入100ug PC61,Treg组同时输入纯化CD4+CD25+Treg(1×106/L细胞制备液,1ml)。3、记录造模后大鼠活动情况、外观变化和48h生存率。4、于6h、12h、24h、48h眼球采血,使用ELISA法测定炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平。5、各时间点流式细胞仪检测外周血Treg细胞占T淋巴细胞的比例。6、使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。计量资料先行正态性检验,数据以均数±标准差表示,两组之间的比较采用独立样本t检验,多组间的比较采用单因素方差分析。P<0.05具有统计学差异,P<0.01具有显著差异。结果1、大鼠脾脏T淋巴细胞经2次免疫磁珠法分选后可获得纯化CD4+CD25+Treg细胞,台盼蓝染色检测细胞存活率维持在96-99%。流式细胞仪检测纯度为92.4%-98.2%。2、一般情况及生存率观察:造模后24h,SEB组和阻断组表现出典型的脓毒症症状;Treg组大鼠早期活动自如,与其他两组相比,临床症状半定量评分明显低于其他2组(P<0.05)。48h后SEB组、阻断组、Treg组生存率分别是70%,30%,90%。3、造模后各时间点三组间所测炎性因子均有差异(P<0.05);SEB组术后持续上升,显著高于制模初期水平(P<0.01)。与SEB组相比,阻断组各时间点上所测各炎性因子均高于后者(P<0.05或P<0.01)。与SEB组比较,Treg组各时间点上所测炎性因子均低于后者(P<0.05或P<0.01)。4、造模后各时间点三组间Treg比例均有差异(P<0.05);SEB组术后持续上升,显著高于制模初期水平(P<0.01)。与SEB组比较,阻断组各时间点上Treg比例均低于后者。(P<0.05或P<0.01)。与SEB组比较,Treg组各时间点上Treg比例均高于后者(P<0.05或P<0.01)。结论1、采用免疫磁珠法两次分选可以分离大鼠脾脏纯度高、活性好的调节性T细胞,适合进一步研究。2、treg活性在金葡菌肠毒素B致脓毒症模型中早期可以减轻器官损害程度和降低早期病死率,其机制是上调Treg细胞水平可以抑制促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的分泌,可以下调金葡菌感染早期过度的炎症反应,相反地,以PC61阻断或封闭Treg后大鼠对SEB的耐受水平显著降低。但其具体的信号机制需要进一步研究。