柱花草(Stylosanthes guianensis)作为一种优良的豆科牧草,具有茎叶产量高、营养价值丰富、富含多种氨基酸和维生素等特点,被广泛用于动物的青饲料、干草粉生产、水土保持和放牧,其除了可作为绿肥作物,还可用来土壤固氮、恢复荒地,在我国南方地区普遍应用。可是,当温度低于10℃时,柱花草的生长就会被抑制。本研究从细茎柱花草(S.guianensis var.intermedia)中获得一个较为抗寒的新品系“89-1”,利用新一代Illumina测序技术对该柱花草抗寒新品系进行转录组测序,处理条件为低温(4℃)和适温(28℃)。在转录组测序的基础上,本研究对细茎柱花草SgiMYB基因进行克隆及功能分析,主要研究结果如下:(1)根据转录组测序获得SgiMYB基因,通过对柱花草89-1进行RNA的提取和cDNA合成,克隆出SgiMYB基因的c DNA全长,基因全长为879 bp。在SgiMYB的蛋白结构中N末端含有一段保守的SANT结构域,属于SANT亚族。对SgiMYB氨基酸进行一个多重序列比对和进化分析,发现SgiMYB基因属于一个MYB-related转录因子亚族中的一个CCA1-like亚群的转录因子。(2)构建了酵母诱饵载体pGBKT7-SgiMYB和亚细胞定位载体pAN580-SgiMYB,发现SgiMYB基因有很强的转录激活性,同时SgiMYB基因蛋白定位于细胞核中。定量分析柱花草在4℃低温处理下,SgiMYB基因在根、茎和叶组织的表达模式,在4℃低温处理2h后SgiMYB基因表达量迅速上升,但随着低温处理时间增长表达量升高趋势不明显,组织表达呈现出叶>茎>根的特点。(3)构建过表达SgiMYB载体pBA002-SgiMYB,利用农杆菌介导法转化烟草,成功获得异源过表达转基因烟草株系,并挑取出3个转基因株系(OE-3、OE-4和OE-5)进行实验。在不同时间的低温处理下,转基因株系与野生型株系的表型发生变化,当低温处理24h和48h时,转基因株系抗寒能力明显高于野生型;在低温处理下转基因株系SgiMYB基因相对表达量明显高于野生型。对转基因烟草各项抗寒生理指标进行测定,结果表明低温处理12h后,野生型烟草的丙二醛含量和电导率均明显高于转基因株系,并且差异显著;在6h的低温处理后,转基因株系的脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型株系,但只有在24h的低温处理下才呈现出显著性差异;而可溶性蛋白含量变化不明显。这些结果表明,过表达SgiMYB基因可提高植物的抗寒能力。选取OE-3株系与野生型株系进行低温处理,并进行下游抗寒基因(CBF1、CBF3和ERD10)的定量分析,发现在低温处理2h、12h和24h下的OE-3株系CBF1基因表达量明显高于野生型株系;OE-3株系的CBF3基因的表达量在低温处理6h前低于野生型株系,处理12h和24h时明显高于野生型株系;而ERD10基因表达量在低温处理下都呈现出OE-3株系远远高于野生型株系的现象。这些结果表明SgiMYB基因参与植物抗寒胁迫调控,从中可推测出SgiMYB基因可能直接或间接控制抗寒相关基因的表达,进而调控植物的抗寒能力。