结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis, TBM)是由结核分枝杆菌引起的脑膜非化脓性炎症,病情凶险,死亡率和致残率极高,其预后与早期诊断、及时治疗密切相关。TBM临床表现差异较大,常被误诊为不典型化脓性脑膜炎(化脑)和隐球菌脑膜炎(隐脑)等而延误治疗。蛋白质是生命存在和运动的物质基础,对蛋白质群体尤其是蛋白质组的系统研究,将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。近年来差异蛋白质组学研究的深入和生物信息技术的日益成熟,为从蛋白质水平研究重大疾病的基础、寻找新的诊断标志物和治疗靶点开辟了一条崭新的道路。中枢神经系统疾病能够显著影响脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中蛋白质的浓度以及蛋白质存在的表达。大量的研究证明了人CSF中的蛋白质及多肽在浓度及结构等方面的变化也能反映中枢神经系统感染的病理生理信息,是一个被忽略的、有待开发的宝库,可被用于寻找发病机制的目标蛋白、早期诊断的生物标记物。CSF本身蛋白含量很低,且大多数为白蛋白和免疫球蛋白,传统方法很难进行分离纯化和鉴定。蛋白质组学技术的发展为系统、全面、高通量地研究中枢神经系统疾病导致CSF蛋白的变化提供了强有力的手段。已有学者通过蛋白质组学方法在CSF中发现了很多神经系统疾病的多个生物标记物,然有关对TBM患者CSF蛋白质组变化定量研究较少有报道。本研究首先应用定量蛋白质组学技术-荧光差异双向凝胶电泳(fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)的蛋白质组学方法,研究TBM患者CSF蛋白质组变化,筛选TBM相关特异性蛋白质。我们收集复旦大学附属公共卫生临床中心感染科2009年1月-2010年7月确诊的TBM急性期患者和对照人群CSF样品各20例。应用2D-DIGE分离TBM患者和对照组CSF总蛋白,通过Decyder V5.0软件分析两组差异表达的蛋白质点(Ratio>2.0, P<0.05), MALDI-TOF-MS对差异表达的蛋白质点进行分析,结合数据库进行搜索鉴定。通过搜索Wiss-Prot/UniProtKB数据库和Gene Ontology (GO)确定差异蛋白质的亚细胞定位和分子功能。部分差异蛋白质在CSF中的表达情况进行了分子酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)验证。最终成功建立了基于2D-DIGE结合MALDI-TOF-MS的TBM组和对照组CSF差异表达蛋白筛选与鉴定的技术路线。通过DIGE及DeCyder5.0软件分析,在TBM组和对照组之间发现Ratio值大于2.0差异蛋白质考染点13个。将这13个差异蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析,数据库进行搜索后匹配到蛋白质点有6个。其中在TBM患者CSF中上调蛋白2个：载脂蛋白AIV (Apolipoprotein A-IV, APOA4)、和血清类粘蛋白1(Orosomucoid1, ORM1);下调蛋白质4个：载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)、载脂蛋白A-1(Apolipoprotein A-I, APOA1)、维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein, GC)、转甲状腺素蛋白(Transthyretin, TTR)。ELISA实验证实了差异蛋白APOE在TBM组中的低表达,变化趋势与质谱分析结果一致。其次,我们应用多重同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)标记结合液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)研究TBM患者CSF蛋白表达谱,并对TBM、隐脑患者和对照人群CSF中蛋白质表达量进行比较分析,筛选疾病关键蛋白质,以寻找TBM早期诊断的生物标记物和探索TBM发生发展的分子机制。结果在TBM组CSF中共鉴定到置信度≥95%的蛋白质208个,分子量范围为10KD-135KD。每个蛋白质至少含有一个以上符合率95%的肽段。GO分析显示大部分蛋白质定位于细胞外成分、膜成分和细胞器成分,没有鉴定到结核杆菌同源蛋白质。大部分蛋白质与转运、结合、酶催化调节、细胞诱导相关,并参与生物学调节、代谢、免疫应激、细胞进程等。与隐脑患者和对照人群比较TBM患者CSF中蛋白表达上调1.0倍以上的蛋白质有6个：载脂蛋白AIV (Apolipoprotein A-IV, APOA4),载脂蛋白B100(Apolipoprotein B-100, APOB)、血清类粘蛋白1(Orosomucoid1, ORM1)、a1-抗糜蛋白酶(a1-antichymotrypsin, SERPINA3)、抗菌肽(Cathelicidin antimicrobial peptide, CAMP)、S100钙结合蛋白A8(S100Calcium-binding Protein A8,S100A8);下调1.0倍以上的蛋白质有3个：载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)、钙同线蛋白1(Calsyntenin1, CLSTN1)、人前列腺素D合成酶(Prostaglandin D2synthase, PTGDS)。采用ELISA法验证差异蛋白质APOB、S100A8在TBM组、隐脑组和对照人群CSF中表达水平,结果显示差异有统计学意义(P<0.05),与质谱分析结果一致。综上所述,我们应用新近发展的定量差异蛋白质组学技术-2D-DIGE和iTRAQ串联高分辨质谱(Mass spectrometry, MS)共鉴定了12个结脑相关差异表达蛋白质,主要涉及到钙离子结合、脂质代谢、炎性免疫反应、信号传导、细胞凋亡等生物学过程。这些差异性蛋白质在TBM的发生、发展过程中可能起到促进或抑制作用。有些蛋白如PTGDS, CLSTN1和S100A8为首次在TBM患者脑脊液中发现异常表达,可能是TBM的潜在生物标记物。关于它们在TBM发病机制中作用的讨论大多属于推测性质,因而需要今后进一步的研究来证明。此外,通过对2D-DIGE和iTRAQ-LC-MS/MS两种定量蛋白质组方法筛选出的差异蛋白质对比分析,我们发现这两种方法获得的差异蛋白质组数据既有交叉,又能在一定程度上互补。只有将两种定量蛋白质组学技术结合起来才能全面了解TBM患者CSF蛋白质组变化情况。