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乳酸菌作为一种具有益生功能的革兰氏阳性菌,能发酵碳水化合物。植物乳杆菌(Lb.plantarum)具有高黏附性及疏水性使其不但能在肠道定植,成为优势菌群,发挥其免疫调节活性,而且可以直接捕获病毒,起抗病毒作用。作为一种益生菌,将其作为载体递呈药物或保护性抗原蛋白,具有广泛应用。通过锚定蛋白作为表面展示原件,使外源蛋白锚定表达在新功能型植物乳杆菌表面,提高了外源蛋白的局部浓度并减少其在消化道的水解。猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是两种肠道冠状病毒,能引起仔猪腹泻、脱水、呕吐等症状,具有较高的死亡率。两种病毒的共感染越发频繁,因此,开发一种新药用来预防和治疗混合病毒感染的仔猪腹泻尤为重要。Ⅲ型干扰素(IFN-λ)在上皮组织抗病毒初期起着重要的防御作用。IFN-λ通过Jak-STAT通路抑制病毒的感染和复制,上调通路下游的ISGs表达,使邻近健康细胞进入抗病毒状态。为了构建锚定表达猪IFN-λ3植物乳杆菌,将干扰素的抗病毒活性与乳酸菌的益生特性结合,发挥新功能型乳酸菌的抗病毒功能,本研究分为四个部分:(1)首先对CWA蛋白结构进行预测,获得锚定蛋白CWA,并构建锚定表达新功能型植物乳杆菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-EGFP-CWA(Lb.plantarum-409EC)。通过流式细胞术、Western Blot、直接免疫荧光等方法检测新功能型植物乳杆菌锚定EGFP的能力。测定最佳诱导条件和新功能型乳酸菌的生长速率等。(2)其次构建重组大肠杆菌BL21-pET-30a-IFN-λ3,经IPTG诱导后通过Western Blot验证目的蛋白成功表达在包涵体内。纯化、复性IFN-λ3蛋白并验证了其抗PEDV和TGEV的活性。(3)构建新功能型植物乳杆菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-IFN-λ3-CWA(Lb.plantarum-409IC)、Lb.plantarum-pSIP-409-pgsA′-IFN-λ3(Lb.plantarum-409P′I)并通过流式细胞术和Western Blot验证IFN-λ3在菌株表面表达成功,证明了CWA锚定方式比pgsA′能更高效的锚定表达猪IFN-λ3。(4)将诱导后的新功能型乳酸菌和IPEC-J2细胞共培养,并用PEDV和TGEV分别感染IPEC-J2细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)证实,两种新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC、Lb.plantarum-409P′I在不同浓度和时间点均可显著抑制PEDV、TGEV两种病毒在IPEC-J2中的RNA转录水平(0.01<p<0.05),且新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抑制病毒复制作用更强。通过间接免疫荧光证明与对照组相比,新功能型乳酸菌处理组在IPEC-J2/PEDV系统和IPEC-J2/TGEV系统中病毒载量明显降低。qPCR测定IPEC-J2细胞经新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC刺激后,干扰素刺激基因:干扰素刺激基因15(ISG15)、抗粘液病毒基因(Mx1)、和干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)的相对表达量均明显上调。表明该新功能型乳酸菌可以通过提高IPEC-J2抗病毒基因的相对表达量,起到一定抑制病毒复制的作用。本研究证明了CWA和pgsA′两种蛋白都能将猪IFN-λ3锚定在植物乳杆菌表面,并发现新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抗PEDV和TGEV效果更强,本研究为新型乳酸菌制剂预防和治疗猪PEDV、TGEV感染奠定了一定基础。