目的：　　尽管TFF3的功能非常明确，但其上游调控机制尚不清楚，miRNA参与到了IBD的发病过程，设想如果能弄清TFF3表达的上游调控因子，弄清是哪个miRNA调控了TFF3的表达，那么在炎症性肠病等病理情况下进行人为干预，以促进TFF3上调表达，从而使其更好的发挥黏膜保护及损伤修复作用，将会成为治疗IBD的一条新思路。miRNAs在免疫系统疾病中的作用越来越得到人们的重视，那么其对IBD肠屏障是否有影响，机制如何，本文将进行深入研究。　　方法:　　1、生物信息学预测　　通过Targetscan软件预测能与TFF33UTR端相结合的miRNA，通过文献筛选，最终确定miR-7/miR-375为目标miRNA。　　2、组织水平检测TFF3蛋白及miR-7/miR-375表达情况　　收集IBD患者病变处肠组织及正常组织，通过免疫组化的方法测定病变组织及正常组织中TFF3的相对表达量，同时qRT-PCR法检测病变组织及正常组织中miR-7/miR-375表达情况。　　3、荧光素酶报告基因检测证实miR-7可以与TFF33UTR端相结合　　4、miR-7和TFF3的关系　　在细胞水平证实miR-7可以下调TFF3蛋白的表达。培养细胞融合至80％时根据论文二分组分别转染不同试剂，通过western blot方法检测TFF3蛋白表达情况。　　5、miR-7对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响　　培养细胞融合至80％时根据论文二分组分别转染不同试剂，通过MTT法检测各组间细胞增殖情况，通过细胞划痕实验及transwell法检测各组细胞间细胞迁移情况。　　6、miR-7和TFF3对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响与PI3K/AKT通路之间的关系　　培养细胞融合至80％时根据论文二及论文三分组分别转染不同试剂，通过western blot方法检测TFF3、PI3K、AKT及p-AKT蛋白表达情况。通过MTT法检测各组间细胞增殖情况，通过细胞划痕实验及transwell法检测各组细胞间细胞迁移情况，研究miR-7对TFF3的调控进而影响肠上皮细胞增殖和迁移能力是否由PI3K/AKT通路介导的。　　结果:　　一、利用生物信息学软件预测miRNA　　本实验中我们应用计算机生物信息学软件对可能调控TFF3功能的目标miRNAs进行了预测，在IBD中miR-7/miR-375可能通过调控TFF3的表达，进而影响肠黏膜屏障功能，影响疾病的转归，因此本文将miR-7/miR-375作为研究的候选miRNAs。　　二、组织水平TFF3蛋白与miR-7表达呈负向相关　　结果显示，溃疡病变组织处TFF3排列紊乱，且大部分表达缺失，正常组织中组织中可见TFF3呈花环状排列，分布均匀。病变组织TFF3光密度值32.0481±4.76，正常组织TFF3光密度值71.5226±4.34，病变组织TFF3相对表达量较正常组织下降，差异显著(P＜0.05)。qRT-PCR检测miR-7/miR-375的表达情况，结果显示，miR-7于病变组织中高表达，于正常组织中低表达(P＜0.05);而miR-375的差异性表达不明显(如表1.1图1.2)。提示miR-7与TFF3在病变组织和正常组织中表达呈负向相关。　　三、miR-7对TFF3、PI3K、AKT、p-AKT蛋白的影响　　不同组细胞分别转染了miR-7mimics后检测TFF3、PI3K、AKT、及p-AKT蛋白的表达情况，结果显示，转染miR-7mimics组TFF3、PI3K、及p-AKT蛋白表达下降(P＜0.05)，AKT表达无差异;转染miR-7inhibitor后TFF3表达升高(P＜0.05)。可见miR-7可以抑制TFF3的表达，提示miR-7下调TFF3的表达的同时抑制PI3K/AKT通路的活化。　　四、miR-7对肠上皮细胞增殖能力的影响　　结果显示，LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组三组间细胞抑制率无差异。而无论是24h、48h还是72h，miR-7mimic组对细胞均是抑制细胞增殖，miR-7inhibitor组对细胞均是促进细胞增殖（表2.4）;miR-7mimic组的细胞OD值明显小于LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组;miRNA inhibitor组细胞OD值明显大于LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　五、miR-7对肠上皮细胞迁移能力的影响　　细胞划痕实验:结果显示，如图片2.3、表2.5、图2.4所示，miR-7mimic组的细胞划痕间隙明显大于LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组;而miRNA inhibitor组细胞划痕间隙明显小于LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组;miR-7mimic组的细胞迁移率小于LS174T空白对照组、miRNA mimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组;而miRNA inhibitor组细胞迁移率大于LS174T空白对照组、miRNAmimic阴性对照组和miRNA inhibitor阴性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　transwell细胞迁移实验:结果显示，空白对照组、miR-7mimic阴性对照、miR-7inhibitor阴性对照组穿过Transwell小室的细胞个数无统计学差异，miR-7mimic组穿过Transwell小室的细胞个数较比空白对照组、miR-7mimic阴性对照、miR-7inhibitor阴性对照组明显减少，而miR-7inhibitor组穿过Transwell小室的细胞个数空白对照组、miR-7mimic阴性对照、miR-7inhibitor阴性对照组增多，二者具有统计学差异，P＜0.05。　　六、miR-7和TFF3对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响与PI3K/AKT通路之间的关系　　结果显示，miR-7可以靶向调控TFF3进而抑制肠上皮细胞增殖和迁移能力;同时miR-7可以下调PI3K及p-AKT蛋白表达而抑制肠上皮细胞增殖和迁移能力;加入PI3K/AKT通路抑制剂后miR-7抑制肠上皮细胞迁移的作用增强，且PI3K/AKT通路抑制剂可以促进miR-7对TFF3的下调作用，提示miR-7调控TFF3影响肠上皮屏障功能的过程中有PI3K/AKT通路的参与。　　结论:　　1、生物信息学预测miR-7/miR-375可以与TFF33UTR端结合;　　2、miR-7在IBD病变组织高表达，正常组织低表达;TFF3蛋白在IBD病变组织低表达，在正常组织高表达，二者呈相反趋势;　　3、miR-375对TFF3的调控作用不明显;　　4、miR-7可以在转录后水平调控TFF3蛋白表达;　　5、miR-7可以靶向调控TFF3进而抑制LS174T细胞的增殖和迁移能力;　　6、miR-7调控TFF3影响细胞增殖和迁移能力过程需要PI3K/AKT通路的参与。　　7、PI3K/AKT通路可能对miR-7存在一种反馈调节作用，抑制该通路活性能够提高miR-7水平，进一步加强miR-7对细胞增殖、迁移的影响。