研究背景:免疫性血小板减少症(ITP)属获得性、异质性、自身免疫性疾病,以孤立性血小板减少为主要特征,是临床实践中最常见的出血性疾病,约占所有出血性疾病的1/3。ITP缺乏实验室特异性的“金标准”,尽管2019新版共识已出版,但其主要聚焦于治疗,ITP迄今为止仍为排除性诊断。ITP主要分为原发性和继发性,前者是指排除所有已知的继发性ITP病因,而继发性ITP主要是指由遗传或获得性易感疾病所触发的,例如:自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征等)、甲状腺疾病、药物诱导的血小板减少、同种免疫性血小板减少、淋巴系统增殖性疾病、骨髓增生异常(再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征)、恶性血液病、慢性肝病、脾功能亢进、血小板消耗性减少、妊娠血小板减少、急慢性感染、假性血小板减少以及先天性血小板减少等。ITP的发病机制复杂,为多种机制综合作用的结果,其中对自身抗原的免疫失耐受是最基本的机制。而ITP经典的发病机制为特异性血小板自身抗体介导及细胞毒T细胞直接杀伤血小板,导致血小板破坏增多。同时细胞毒T细胞协同血小板自身抗体可直接作用于骨髓巨核细胞,导致其成熟障碍,从骨髓水平影响血小板的生成。此外,近几年来,血小板去唾液酸化,并导致其在肝内破坏,这是非依赖免疫球蛋白Fc部分c末端受体(Fc受体)的血小板清除之重要途径。ITP的治疗遵循个体化原则,需权衡患者年龄、出血程度、合并症、合并用药等因素。其治疗策略旨在恢复与止血作用相匹配的血小板计数而并非使血小板计数恢复正常值。一线治疗专注于抑制自身抗体的产生和血小板破坏,皮质类固醇为ITP一线治疗的首选,能够广泛调节自身免疫紊乱状态。其主要包括传统剂量的泼尼松及大剂量地塞米松。鉴于传统剂量泼尼松需逐渐减量、疗程较长,大剂量地塞米松因起效快、疗程短、皮质类固醇副作用大大减少等优势而逐渐取代传统剂量泼尼松。虽皮质类固醇有效经济,但临床仍有大约1/3的患者对其无效,需转入二线治疗。二线治疗为FTP患者长期治疗的主要方式,主要包括抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗、重组人血小板生成素受体激动剂(recombinant human thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA)、脾切除、免疫抑制剂等。随着新的治疗药物不断出现,以及手术相关的感染、血栓及致死等相关风险,脾切除率逐渐下降。文献报道,继发性 ITP(HCV 相关),即 Secondary-ITP(HCV-associated)患者较原发性ITP患者,其出血的发生率更高、严重程度更重,在临床上严重影响患者手术及有创操作、增加输注血小板花费、输血相关风险及影响抗病毒药物的应用,成为临床大夫面临的棘手问题,而亟待发现新机制并可能为提升血小板治疗提供依据。而作为人-鼠嵌合单抗抗体利妥昔单抗,能够与B细胞表面特异性跨膜受体CD20结合,从而引起B细胞的打孔效应,其中可能的机制包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等,最终导致B细胞清除。其总有效率达60%,长期有效率达20～25%,因相当于“药物性脾切除”,在原发性ITP治疗中越来越受到重视。但其价格相对昂贵,临床上尚缺乏对其治疗反应预测的指标。本研究通过应用荧光素标记的ECL和RCA-I抗体的平均荧光强度及实时定量PCR法检测血小板脱唾液酸化和Neu1表达的水平,首次为出血风险更为严重的Secondary-ITP(HCV-associated)患者血小板清除的发病机理提供了新的见解,为提升血小板治疗提供了有力的理论依据。同时,应用抗核抗体(ANA)检测,评估利妥昔单抗在原发性ITP患者治疗中的近期及远期治疗效果,并比较了其他检测指标的可能干扰作用,为临床预测ITP中利妥昔单抗治疗反应提供了有效的实验室指标,填补了国内外空白。第一部分:血小板去唾液酸化:继发性免疫性血小板减少症(丙型肝炎病毒相关)的一种新型发病机制及干预机制研究研究目的:本研究通过检测继发性ITP(HCV相关)即Secondary ITP(HCV-associated)患者和正常对照血小板去唾液酸化水平,分析两组血小板去唾液酸化水平的关系,并分析与血小板破坏的相关性;检测继发性ITP(HCV相关)患者抗丙肝病毒治疗前后的血小板去唾液酸化水平,分析其与疗效的关系;检测治疗后血小板去唾液酸化及神经氨酸酶1(neuraminidase 1,Neu1)表达水平。从而明确继发性ITP(HCV相关)患者体内是否存在血小板去唾液酸化水平的异常,血小板去唾液酸化水平在HCV病程进展及治疗过程中及之后的变化。旨在诠释Secondary ITP(HCV-associated)的一种新的发病机制,从而为 Secondary ITP(HCV-associated)的治疗提供新的干预措施。研究方法:1.入组45例Secondary ITP(HCV-associated)患者,接受直接抗病毒药物(DAA)治疗,治疗前收取外周血,治疗开始12周后,评价临床疗效,并且收取外周血。同时入组21例健康志愿者作为正常对照,血常规检测血小板数目。2.采用流式细胞术检测血小板去唾液酸化后暴露的β半乳糖(βGals)的水平,即以PE-Cy5-CD41a单克隆抗体标记血小板,并同时与FITC-ECL,FITC-RCA-I共孵育,以后两者的平均荧光强度用来反映血小板的去唾液酸化水平。3.应用RT-PCR法检测Secondary ITP(HCV-associated)患者和正常对照、治疗前后的Neu1拷贝数。结果:1.Secondary ITP(HCV-associated)患者血小板ECL、RCA-I的平均荧光强度显著高于正常对照。2.Secondary ITP(HCV-associated)患者治疗后持续病毒学应答12周(SVR12)及NR率分别为91.4%、8.6%,SVR12患者治疗后ECL、RCA-I的平均荧光强度均较治疗前显著降低,而NR患者治疗前后ECL、RCA-I的平均荧光强度无统计学差异。3.Secondary ITP(HCV-associated)患者较健康对照组相比,其Neu1拷贝数更高。结论:1.试验组Secondary ITP(HCV-associated)患者血小板去唾液酸化水平明显高于健康对照组。2.经DAA治疗后,雷迪帕韦/索非布韦(吉二代)及维帕他韦/索非布韦(吉三代)组患者血小板去唾液酸化水平均下降,血小板计数水平升高,从而阐明血小板去唾液酸化水平的升高可能与慢性丙肝患者血小板减少的发生存在密切关联,这为丙肝合并血小板减少症的新机制,从而有望为Secondary ITP(HCV-associated)患者提供新的治疗策略。3.第二部分:原发免疫性血小板减少症抗核抗体与利妥昔单抗干预反应的相关性研究研究目的:检测原发性ITP患者利妥昔单抗治疗前外周血中ANA水平,对比ANA阳性和阴性ITP患者的早期疗效,包括有效率和起效时间;同时评价两组间性别、年龄、初始血小板计数、IgG水平、骨髓中巨核细胞计数、不同利妥昔单抗剂量对利妥昔单抗治疗反应可能的影响,通过对比ANA阳性组及阴性组ITP患者随访半年、1年及2年的持续缓解率,比较二者的远期疗效,并评价二者的生存曲线。从而为ITP利妥昔单抗的治疗反应提供了有力的预测指标。研究方法:1.应用连续队列研究的方法,回顾性地分析了国内三家中心,分别为山东大学齐鲁医院、烟台毓璜顶医院、泰安中心医院成人原发性ITP患者的临床记录(2012.01-2018.12),选取应用利妥昔单抗治疗的患者共287例。2.通过免疫荧光技术在Hep-2细胞底物上测定ANA。3.根据患者治疗前体内ANA滴度,分为ANA 阳性组98例和阴性组189例。4.同时收集患者年龄、性别、疾病持续时间、基线血小板计数、血清免疫球蛋白(Ig)G水平,骨髓巨核细胞计数及出血评分。5.所有患者随访时间至少于利妥昔单抗治疗后2年,评估ANA阳性组及阴性组ITP患者的早期、远期有效率。对前者的评价是基于国际最新ITP诊疗及实践指南,而后者则是指,获得早期缓解后患者外周血小板计数持续达30×109/L以上的时间。结果:1.ANA阳性组及阴性组在性别、年龄、初始血小板中位计数、IgG中位水平、ITP持续时间、出血分数、骨髓巨核细胞中位计数间均无显著差异。2.ANA阳性组较ANA阴性组相比,早期有效率明显升高,有明显的统计学差异。3.ANA阳性组随访6个月时总有效率及完全反应(CR)率呈直线下降,而ANA阴性患者的总有效率及CR率下降不明显。4.ANA阳性组在随访1年后总有效率低于5%,随访2年后有效率接近0。而ANA阴性组在在随访1年后总有效率仍达35.4%,缓解率达19%,随访2年后总有效率仍高于20%。结论:1.与利妥昔单抗治疗后的ANA阴性组相比,ANA阳性组的ITP患者的早期总有效率及完全反应率更高,但远期有效率更短。2.ANA阴性组的远期有效率与其他利妥昔单抗治疗的研究报告相当。3.ANA筛查可能是预测ITP中利妥昔单抗治疗反应的有效指标。