仔猪的出生、断奶以及日粮和环境的变化等极易导致肠道氧化应激,进而损伤肠道屏障,导致养分消化吸收障碍、仔猪腹泻等问题,严重影响仔猪的生长性能,降低养猪生产效益。因此,如何通过营养技术缓解仔猪肠道氧化应激是生猪养殖中面临的严峻挑战。硒是动物必需的一种微量元素,在体内最重要的功能是抗氧化作用。无机硒的安全阈值窄,易引起动物毒性反应。而普遍认为安全性较高的硒代蛋氨酸可替代蛋氨酸合成蛋白质,可能导致硒的累积毒性。近年来的研究表明纳米单质硒是一种具有高效抗氧化、免疫调控活性和高安全性的硒形式。已有的化学方法制备纳米单质硒稳定性差,需要加入分散剂或保护剂,工序复杂成本高。本研究旨在通过微生物转化合成生物纳米单质硒,并评估生物纳米单质硒抗肠道氧化应激的功效。本实验室前期分离得到的高产多糖、耐硒菌株EnterobactercloacaeZ0206不仅能高效合成富硒蛋白多糖,而且可将亚硒酸钠转化成生物纳米单质硒。因此,本研究首先优化E.cloacaeZ0206合成生物纳米单质硒的条件,初步探讨了其合成生物纳米单质硒的机制,并对E.cloacaeZ0206合成的生物纳米单质硒进行特性表征;进一步利用小鼠肠道氧化应激模型和猪空肠上皮细胞氧化应激模型,以硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒为对照,研究了生物纳米单质硒抵抗肠道氧化应激,保护肠道屏障的作用:阐明了生物纳米单质硒通过激活Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用的机制。主要研究结果如下:1E.claacae Z0206生物纳米单质硒的制备与特性表征1.1 E.cloacae Z0206生物纳米单质硒合成。(1)培养基中添加不同浓度亚硒酸钠显著抑制E.loacaeZ0206的生长,且抑制作用呈现剂量依赖性。(2)通过Michaelis-Menten动力学方程分析发现,E.cloacaeZ0206还原亚硒酸钠的速率随着亚硒酸钠添加量的增加而提高,且亚硒酸钠适宜添加量为10mM,发酵时间约为144h。(3)扫描电镜、透射电镜结合能谱分析发现,E.cloacae Z0206将亚硒酸钠还原为球状、纳米级单质硒颗粒。上述结果提示,E.cloacaeZ0206可商效还原亚硒酸钠并合成生物纳米单质硒,且亚硒酸钠添加董为10 mM,发酵时间为 144 h。1.2 E.claacae Z0206生物纳米单质硒的合成机制。(1)分析E.cloacae Z0206菌体不同组分(胞膜蛋白、胞质蛋白和培养基上清蛋白)的亚硒酸钠还原能力发现,仅胞膜蛋白可还原亚硒酸钠生成生物纳米单质硒。(2)通过iTRAQ蛋白质组学研究发现,亚硒酸钠对E.cloacaeZ0206菌体Painter-type反应相关蛋白的表达无显著影响,但显著提高富马酸还原酶的表达。实时荧光定量PCR结果与iTRAQ结果一致。(3)进一步探究了富马酸还原酶在E.cloacaeZ0206还原亚硒酸钠过程中的作用,发现富马酸处理可显著抑制E.cloacaeZ0206还原亚硒酸钠的效率;敲除富马酸还原酶基因同样显著减低E.cloacae Z0206还原亚硒酸钠的效率,表明富马酸还原酶在E.cloacaeZ0206还原亚硒酸钠过程中的关键作用。上述结果提示,E.cloacaeZ0206主要通过胞膜蛋白富马酸还原酶将亚硒酸钠还原为单质硒。1.3 E.cloacae Z0206生物纳米单质硒特性表征。利用第一节优化的合成条件制备生物纳米单质硒,经过提纯,对其特性进行全面表征。结合透射电镜、能谱分析和纳米粒度分析发现生物纳米单质硒是粒径均匀、单分散的球状颗粒,粒径约为80-250 nm,平均粒径为139.43 ± 7.44 nm;通过X射线光电子能谱分析确认生物纳米单质硒中硒的价态为0价;通过傅里叶红外变换光谱分析发现生物纳米单质硒表面含有氨基、羧基、羟基、羰基等蛋白质、多糖特征性基团。上述结果提示,生物纳米单质硒是一种粒径均匀、单分散的球状纳米颗粒,表面包被细菌合成的蛋白质和多糖。2生物纳米单质硒抗小鼠肠道氧化应激的功能研究2.1.小鼠肠道氧化应激模型的构建。给小鼠腹腔注射不同剂量Diquat(0-100 mg/kg体重),发现50-100 mg/kg Diquat均可导致小鼠死亡。对0-25 mg/kg组小鼠组织样品分析发现,25mg/kgDiquat显著提高小鼠血清中ALT、AST、DAO活性和DLA含量,表明25 mg/kg Diquat处理可诱导小鼠肝脏和肠道屏障损伤。对小鼠肝脏和各肠段(十二指肠、空肠、回肠和结肠)氧化还原状态研究发现,25 mg/kg Diquat显著提高空肠中ROS和MDA含量;但对肝脏和其他肠段ROS含量影响无明显规律。此外,25 mg/kg Diquat显著提高空肠中TrxR和GPx活性,而对肝脏中两种酶活性无显著影响,表明25 mg/kg Diquat处理诱导小鼠空肠发生抗氧化反应。上述结果提示,腹腔注射25mg/kgDiquat可成功诱导小鼠空肠氧化应激,后续试验以此方法构建小鼠肠道氧化应激模型,且确定空肠为研究的目标组织。2.2生物纳米单质硒在小鼠上的适宜剂董筛选。以不同剂量生物纳米单质硒(0-2 mg/kg体重)连续灌胃小鼠7天,发现各组小鼠采食量和体重差异并不显著。生物纳米单质硒对小鼠血清中ALT、AST酶活,肝脏和空肠中MDA含量均无显著影响,说明生物纳米单质硒未对小鼠肝脏和空肠造成氧化损伤。对小鼠空肠中含硒酶GPx和TrxR活性分析发现,生物纳米单质硒可显著提高空肠中GPx和TrxR活性,且存在明显的剂量依赖效应,且0.5mg/kg剂量可以使GPx和TrxR活性达到峰值,因此后续小鼠模型试验生物纳米单质硒剂董确定为0.5 mg/kg。2.3生物纳米单质硒抑制小鼠肠道屏障氧化损伤的功能研究。利用上述构建的小鼠肠道氧化应激模型,以硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒为对照,研究了生物纳米单质硒对小鼠肠道屏障氧化损伤的影响。研究发现,(1)氧化应激导致小鼠肠道对FD4的通透量、血清DAO活性和DLA含量显著增加,表明肠道氧化应激导致肠道屏障严重损伤;而生物纳米单质硒预处理显著抑制血清FD4、DAO和DLA水平的提高,抑制了肠道屏障的氧化损伤,且效果显著优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。(2)肠道氧化应激导致空肠上皮细胞凋亡,使空肠绒毛萎缩呈现锯齿状;生物纳米单质硒预处理显著抑制氧化应激导致的上皮细胞凋亡,保护绒毛形态,且效果显著优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。(3)氧化应激组小鼠空肠ROS含量、MDA含量显著提高,而生物纳米单质硒预处理可显著抑制空肠中ROS和MDA含量增加,保护空肠氧化还原稳态,效果优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。(4)氧化应激模型组和三种形式硒预处理组空肠GPx和TrxR活性均显著高于对照组,且生物纳米单质硒预处理组GPx活性显著高于其他组,说明氧化应激导致小鼠空肠产生抗氧化反应,而生物纳米单质硒可更高效提高空肠抗氧化酶活性抵抗氧化应激。上述结果提示,生物纳米单质硒可商效提高抗氧化酶活性,维持肠道氧化还原稳态,抑制肠道屏障的氧化损伤,且效果明显优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。3生物纳米单质硒抗猪肠道上皮细胞氧化应激的功能研究3.1生物纳米单质硒抑制猪肠道上皮细胞氧化损伤的功能研究。(1)预实验:确定以60μM Diquat构建IPEC-J2细胞氧化应激模型;确定生物纳米单质硒、硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒的处理剂量为0.1 μM。(2)以Transwell体外模拟肠道屏障,Diquat处理使上皮细胞TER值迅速降低,并在7h内降至最低,破坏上皮屏障,显著增加单层上皮细胞对FD4的通透量。生物纳米单质硒预处理显著抑制了 TER的降低和FD4通透量的增加,抑制IPEC-J2细胞屏障的氧化损伤。而硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒对IPEC-J2细胞屏障的氧化损伤无明显缓解作用。(3)Diquat处理显著提高Bax和activecaspase-3表达,抑制Bcl-2表达,促进细胞凋亡;生物纳米单质硒完全抑制Bax和active caspase-3的增加和Bcl-2的减少,抑制细胞凋亡,效果显著优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。上述结果提示,生物纳米单质硒可显著缓解氧化应激导致的IPEC-J2细胞凋亡,抑制上皮细胞屏障氧化损伤,效果显著优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。3.2生物纳米单质硒对猪肠道上皮细胞氧化还原稳态的影响。与对照组相比,Diquat处理显著提高细胞中ROS、PSSG和MDA含量,降低GSH含量并提高GSSG含量。与Diquat组相比,生物纳米单质硒预处理显著降低ROS、PSSG和MDA含量,提高GSH含量并降低GSSG含量,维持细胞氧化还原稳态。与Diquat组相比,硒代蛋氨酸预处理显著降低细胞ROS、MDA含量,但对GSH、GSSG和PSSG含量无显著影响。化学合成纳米单质硒预处理组与Diquat组差异不显著。上述结果提示,生物纳米单质硒可有效维持IPEC-J2细胞氧化还原稳态,抑制氧化应激的产生,且效果显著优于硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒。4生物纳米单质硒抗肠道氧化应激的机制研究4.1肠道上皮细胞对生物纳米单质硒和化学合成纳米单质硒摄取的差异。以香豆素-6分别标记生物纳米单质硒和化学合成纳米单质硒,结果发现IPEC-J2细胞对生物纳米单质硒的摄取量呈现时间依赖性;然而化学合成纳米单质硒的摄取量较低,在处理6h后,化学合成纳米单质硒摄取量仅为生物纳米单质硒摄取量的1/10。提示,生物纳米单质硒的跨细胞膜转运能力显著优于化学合成纳米单质硒。4.2生物纳米单质硒对Nrf2-ARE通路的影响。(1)Western blot结果表明,生物纳米单质硒可提高Nrf2及其下游抗氧化蛋白TrxR-1、NQO-1、HO-1和Trx的表达,同时显著提高含硒GPx-1的表达;硒代蛋氨酸显著提高含硒酶GPx-1、TrxR-1以及Trx的表达;化学合成纳米单质硒仅显著提高TrxR-1的表达。(2)通过检测酶活性变化验证发现,生物纳米单质硒显著提高NQO-1、HO-1、TrxR和GPx活性,而硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒仅显著提高含硒酶TrxR和GPx活性。上述结果提示,生物纳米单质硒可能通过激活Nrf2-ARE通路和提高含硒酶的活性发挥抗氧化作用,而硒代蛋氨酸和化学合成纳米单质硒仅作为硒供体提高含硒酶的活性。4.3 Nrf2-ARE通路在生物纳米单质硒抗氧化功能中的作用。(1)Western blot和免疫荧光分析表明,生物纳米单质硒对Nrf2-ARE通路的激活呈现剂量依赖效应,且0.1μM生物纳米单质硒可饱和其对Nrf2-ARE通路的激活作用。(2)对生物纳米单质硒不同处理时间的效应研究发现,生物纳米单质硒处理6h时,Nrf2下游抗氧化酶和蛋白表达量达到峰值;而Nrf2表达量在第8h达到峰值,12h以后开始降低,24 h时与对照组差异不显著。(3)生物纳米单质硒对Nrf2核转位(Nrf2-ARE通路的激活)的促进呈现时间依赖效应,且在处理6h时,Nrf2核转位量达到峰值。(4)进一步利用siRNA干扰Nrf2研究发现,干扰Nrf2显著抑制生物纳米单质硒抵抗ROS产生和氧化应激导致的细胞死亡的功能。提示,Nrf2-ARE通路对生物纳米单质硒抗氧化功能具有关键作用。4.4生物纳米单质硒激活Nrf2-ARE通路的机制研究。(1)通过Westernblot研究发现,生物纳米单质硒处理显著提高Nrf2磷酸化水平,提高MAPKs通路(ERK1/2、JNK和p38)和P13K/AKT通路的磷酸化水平。(2)通过抑制剂抑制MAPKs通路和PI3K/AKT通路的激活,发现抑制ERK1/2、p38和AKT磷酸化之后,生物纳米单质硒对Nrf2磷酸化作用被显著抑制;而抑制JNK磷酸化对Nrf2磷酸化水平无显著影响。提示,生物纳米单质硒通过激活ERK1/2、p38和AKT通路来磷酸化Nrf2,进而激活Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。