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表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)吉非替尼(Gefitinib)是肿瘤靶向药物的突出代表。国外研究显示,吉非替尼能够使EGFR突变阳性的非小细胞肺癌(Non-small-cell lung Cancer, NSCLC)患者肿瘤灶缩小。2011年《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》已经将吉非替尼列入EGFR突变阳性患者的一线治疗方案。然而,从临床经验和机制研究等方面的数据都表明：持续应用后难以回避的耐药是制约吉非替尼进一步应用的瓶颈。本研究主要目的是建立对吉非替尼耐药的PC9细胞株,观察耐药前后EGFR信号通路信号分子的磷酸化水平的变化,观察PI3K下游转录因子Fox03a在耐药细胞株中的表达,观察Fox03a磷酸化水平的改变,探讨其与吉非替尼耐药的关系。目的体外培养人肺腺癌细胞株PC9,并构建对吉非替尼耐药的细胞株PC9/GR,观察耐药前后EGFR信号通路信号分子的磷酸化水平的变化,并观察PI3K下游转录因子Fox03a在耐药细胞株中的表达,观察Fox03a磷酸化水平的改变,探讨EGFR通路信号分子与吉非替尼耐药的关系。方法1.细胞培养实验所用PC9细胞、PC9/GR细胞均在环境条件为37℃±0.3℃、相对湿度≥95%、CO2浓度5%±0.1%的细胞培养箱内并用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基传代培养。2.耐吉非替尼的PC9细胞株的建立PC9细胞用高浓度吉非替尼冲击、逐渐增加低浓度吉非替尼诱导的方法建立耐药株,并用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基传代培养,筛选出的能够0.5μmol/L吉非替尼下稳定生长的贴壁细胞。3.吉非替尼对不同耐药程度的PC9/GR细胞株的影响利用MTT法对敏感细胞株PC9和不同程度耐药的PC9细胞株绘制生长曲线,吉非替尼的浓度为0.5,1,5,10,50,100,500,1000,5000,10000nmol/L,处理时间为72h。4.吉非替尼对敏感细胞株PC9中EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响吉非替尼不同浓度(0,0.5,1,2,4μmol/L)处理敏感细胞株PC91小时,提取细胞蛋白,利用Western Blot检测EGFR信号转导通路中Akt和Erk1/2磷酸化水平的变化。吉非替尼1μmol/L处理敏感细胞株PC9不同时间(0,1.5,3,6,12h),提取细胞蛋白,利用Western Blot检测EGFR信号转导通路中Akt和Erk1/2磷酸化水平的变化。5.吉非替尼对不同程度耐药的PC9/GR细胞株EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响吉非替尼1μmol/L处理敏感株PC9和不同程度耐药的PC9/GR细胞株1h,提取细胞蛋白,利用Western Blot检测EGFR, Akt, FoxO3a,Erk1/2膦酸化水平的变化。结果1.吉非替尼对PC9细胞株形态学的影响倒置相差显微镜观察PC9和PC9/GR细胞形态学的变化,PC9细胞呈卵圆形,PC9/GR细胞呈长梭形,细胞形态学发生明显变化。2.吉非替尼对PC9及PC9/GR增殖特性的影响MTT结果表明,敏感株PC9细胞的IC50为0.05±0.011μmol/L。耐药不同程度的PC9/GR的IC50分别为：PC9/GR1的IC50为0.11±0.015μmol/L，PC9/GR2的ICso为0.23±0.061μmol/L,PC9/GR3的IC50为0.45±0.047μmol/L,PC9/GR4的IC50为0.83±0.103μmol/L,PC9/GR5的IC50为1.7士0.153μmol/L。比较敏感株PC9和PC9/GR5的IC50,耐药指数为17倍,说明耐药株建立成功。吉非替尼对PC9细胞的增殖呈浓度依赖性,随着耐药程度的增加,吉非替尼对PC9/GR的作用显著降低。3.吉非替尼对敏感细胞株PC9中EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响Western Blot结果显示,吉非替尼不同浓度(0,0.5,1,2,4μmol/L)处理敏感细胞株PC91小时后,PC9细胞中p-Akt, p-Erkl/2的表达随着浓度的增加逐渐减少,呈浓度依赖性。吉非替尼1μmol/L处理敏感细胞株PC9不同时间(0,1.5,3,6,12h)后,PC9细胞中p-Akt, p-Erk1/2的表达随着作用时间的增加逐渐减少,呈时间依赖性。4.吉非替尼对不同耐药程度PC9/GR细胞株EGFR通路信号分子磷酸化水平的影响Western Blot结果显示,吉非替尼1μmol/L处理敏感株PC9和不同程度耐药的PC9/GR细胞株1h后,细胞中p-EGFR, p-Akt, p-Erk1/2, p-FoxO3a的表达有显著差异,p-Akt, p-Erkl/2, p-Fox03a表达水平随着耐药程度的增强而增加。结论1.成功建立对吉非替尼耐药的PC9细胞株,命名为PC9/GR。2.吉非替尼可显著抑制PC9细胞中p-Akt, p-Erk1/2的表达。3.吉非替尼对EGFR信号转导通路p-EGFR, p-Akt, p-Fox03a, p-Erk1/2的抑制作用随着耐药指数增加而减弱。吉非替尼的耐药与FoxO3a的磷酸化密切相关。