本论文主要研究PTEN-PDK1-Akt信号通路在维持心脏正常功能中的作用。可以分为三个部分：第一部分是研究Akt的上游PTEN和PDK1的对出生后心脏功能的影响。PTEN是一个磷酸酶,可以抑制PIP2向PIP3转变,从而阻止PIP3将Akt招募到膜上,使其不能被磷酸化进而不能被活化,因此PTEN是Akt活化的抑制剂。PDK1是一个激酶,当Akt被招募到膜上时,PDK1磷酸化Akt蛋白的308位苏氨酸（T308）,mTORC2和其他的激酶磷酸化Akt蛋白的473位丝氨酸（S473）,当这两个位点被磷酸化后,Akt就被完全激活,因此PDK1是Akt的激活剂。前人的研究发现用MCK-cre将PDK1在心肌和骨骼肌中敲除会造成心肌细胞变小,凋亡最后心衰致死。MCK-cre敲除PTEN小鼠会有心脏变大,心功能不改变的表型,且这种小鼠中Akt的S473位点磷酸化升高。在本论文中我们用了α-MHC-cre作为工具鼠,这个cre在出生后第7天开始在心肌细胞中表达。用这个cre敲除PDK1后,我们发现心肌细胞与同窝对照小鼠相比变小,2-3个月后这种小鼠死于心衰。通过对不同时期的小鼠心脏做TUNEL染色我们发现只有心衰期的小鼠才有细胞凋亡。所以PDK1敲除小鼠的原发表型是心肌细胞变小。通过做western检测我们发现PDK1敲除小鼠中Akt308位的苏氨酸磷酸化意料之中的下调,但是473位丝氨酸的磷酸化却出乎意料的上调。这一发现跟前人的结果是一致的。至于S473位磷酸化上调有什么生理意义还没有研究,我们推测AktS473位磷酸化上调维持了部分Akt的活性,并对心功能有保护作用。带着这一推测我们在PDK1敲除的基础上通过小鼠交配将Rictor也进行了敲除,拿到了PDK1, Rictor双敲的小鼠（PDK1; RictorDKO）。Rictor是mTORC2的一个组分,敲除Rictor相当于破坏了mTORC2,从而使其不能磷酸化Akt的S473位点。双敲的小鼠生存时间只有20-30天,比PDK1敲除小鼠时间更短。通过组织学分析我们发现双敲小鼠的心肌细胞比PDKl敲除小鼠的更小。通过Western检测我们发现,双敲小鼠中Akt的S473位磷酸化与PDK1敲除小鼠相比下调。从这个实验我们得出结论,AktS473位的磷酸化对维持心脏功能有一定作用。那再升高AktS473位的磷酸化能够挽救PDK1敲除小鼠的表型么?带着这一疑问我们用α-MHC-cre同时敲除了PDK1和PTEN,我们发现PDK1,PTEN双敲小鼠心脏组织中AktS473位磷酸化比PDK1敲除小鼠更高,T308位的磷酸化略有不明显上调。PDK1,PTEN双敲小鼠存活时间变长,大部分都能存活一年以上。组织学分析显示双敲小鼠的心肌细胞比PDK1敲除小鼠略有增大,但与同窝野生型小鼠相比还是小的。但是PTEN除了Akt这个下游底物外还有其他的底物,在这种情况下我们不能排除PTEN的其他底物挽救了PDK1敲除小鼠的表型。为了鉴定AktS473位的磷酸化上调是否是最主要的挽救力量,我们在PDK1,PTEN双敲的基础上又敲除了Akt1,发现PTEN的挽救作用被逆转了,三敲小鼠的存活时间与PDK1敲除小鼠存活时间差不多。心肌细胞大小也与其差不多。PDK1,PTEN,Rictor三敲小鼠的表型比PDK1单敲小鼠的表型要更严重,存活时间也更短。这种三敲小鼠心脏组织中AktS473的磷酸化比PDK1单敲小鼠低。这两个实验都表明AktS473位的磷酸化上调是最重要的挽救力量。通过这部分的研究我们得出以下结论：在心肌细胞中敲除PTEN可以挽救心肌细胞特异性PDK1敲除引起的心衰表型,且这一作用是通过上调mTORC2介导的AktS473位磷酸化进行的。AktS473的磷酸化能增强Akt的活性并对心脏功能有保护作用,这一发现对临床治疗Akt活性降低引起的心脏病有指导意义。第二部分我们研究Akt对出生后心脏功能的影响。Akt家族有Akt1, Akt2,Akt3三个同源异构体,已知这三个蛋白有互补的效应但各自的主要功能又不同。Akt1主要调控细胞生长,Akt2主要调控细胞代谢,Akt3主要调控脑发育。对Akt和心脏的研究有很多,得出的结论有Akt影响心肌细胞的存活,影响心肌细胞的大小,影响心肌细胞的钙信号传导,影响心肌细胞的代谢等。以前对Akt和心脏的研究大都是利用Akt1心脏特异性转基因小鼠作为模型进行的。Akt心脏特异性转基因小鼠有心脏肥厚,最后心衰的表型。这部分我们用了Akt敲除小鼠作为模型进行,我们首先用α-MHC-cre敲除了Aktl,发现这种小鼠没有表型,能正常存活。我们推测是剩余的Akt2和Akt3维持了心脏的功能。所以我们又敲除了Akt2,发现Akt1,2敲除的小鼠心肌细胞变小,1-2个月后心衰致死。为了弄清Akt3在这一过程中是否有作用,我们又在Akt1,2敲除的基础上敲除了Akt3,发现Akt1,2,3敲除小鼠的存活时间更短,20天左右。在出生后第14天我们对Akt1F/F; Akt1F/F;αMHC-cre; Akt1F/F;αMHC-cre;Akt2-/-; Akt1F/F;αMHC-cre;Akt2-/-;Akt3-/-小鼠进行了组织学分析,发现Akt敲除越多,心肌细胞越小。对不同时间点的心脏组织进行TUNEL染色显示起初并没有细胞凋亡,到心衰期时才有凋亡细胞出现。也就是说Akt敲除后最先出现的表型是心肌细胞变小。心肌细胞大小主要是由蛋白合成和蛋白降解控制的,已知GSK3β, mTORC1（?）口S6K作为Akt的下游能控制蛋白翻译,影响蛋白合成,Foxo能调控蛋白降解,因此我们用western检测了在Akt敲除的小鼠心脏中这些蛋白的磷酸化水平,发现控制蛋白合成的GSK3β,S6K,4EBP1磷酸化水平随着Akt的敲除增多逐渐下调,Foxo1的磷酸化水平也逐渐下调,因为Foxo1磷酸化失活降解,因此活化的Foxo1在Akt敲除的小鼠心脏中增多,蛋白降解增加。我们同时还检测了控制血管生成的蛋白含量,发现Ang2, VEGF, eNOS在Akt敲除小鼠心脏中没有明显变化。我们接下来还打算检测Akt敲除是否会影响心肌细胞的糖代谢和脂代谢。通过这部分的研究我们发现,心脏特异性Akt敲除会首先通过减少蛋白合成,增加蛋白降解使心肌细胞变小,然后逐渐引起细胞凋亡造成心衰。Akt1,2,3在这一过程中是剂量互补的。随着其缺失的增多,表型也愈加严重。第三部分我们发现了Akt的一个新底物Hand1,并研究了Akt对其的磷酸化对出生后心脏功能的影响。Hand1又名Hxt1, Thing1或者eHand,是heart and neural crest derivatives expressed1的缩写,它是碱性螺旋-环-螺旋家族的转录因子。已知,它的碱性螺旋1区可以被磷酸化,该区域的磷酸化可以调节它的活性而且Hand1参与很多发育过程,比如心脏发育,肢体发生和滋养层巨细胞的分化。但是,Hand1在出生后心脏中的作用研究还比较少。只知道Hand1心脏特异性转基因小鼠有心律失常的表型。我们通过生物信息学分析发现Hand1的碱性螺旋区含有Akt激酶的底物保守序列,它有可能是Akt的底物。为了验证这一猜测,我们做了一系列体外生化实验,发现Hand1的T107和T109位点能够被Akt磷酸化,而且Akt对Hand1的磷酸化可以影响它与底物的结合能力,从而影响它对其底物的转录激活作用。为了研究Akt对其磷酸化的生理作用,我们制作了Hand1的出生后心脏特异性转基因突变小鼠来分别模拟Akt磷酸化形式（T107D;T109D）和不能被Akt磷酸化形式（T107A;T109A）。我们发现过度磷酸化和非磷酸化的转基因小鼠都有心脏功能缺陷,有心肌细胞增大凋亡,心脏纤维化的表型而且最后会引起心衰和突然死亡。基因芯片分析发现在转基因小鼠中调控细胞代谢的基因下调,调控细胞生长的基因上调,这说明Hand1转基因小鼠心肌细胞功能紊乱。这部分的研究表明Akt可以磷酸化Hand1而且对其的磷酸化不能过多也不能过少,否则会引发心脏病理性改变。综上,本论文在前人研究的基础上进一步的集中详细并尽可能深入的研究了Akt信号通路对出生后心脏功能的影响,发现Akt通路主要调控出生后心肌细胞的大小,细胞凋亡和心衰都是继发表型。我们的研究成果为临床预防和治疗Akt信号通路紊乱引起的心脏病有很好的指导作用。