可注射浓缩血小板纤维蛋白对大鼠烧伤创面愈合的影响

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目的:采集并离心大鼠静脉血液,提取出IPRF(可注射浓缩血小板纤维蛋白),通过对比IPRF与全血中生长因子浓度的差异判断是否成功激活血小板,结合IPRF与血浆血小板计数的差异判断是否成功制备IPRF;将IPRF用于治疗大鼠深Ⅱ度烧伤创面,观察在大鼠烧伤创面愈合过程中及愈合后IPRF在局部创面的组织抗炎、抗感染、促进组织修复愈合、缩短愈合时间、提高愈合质量等方面所起到的作用,明确IPRF促进组织修复的机制与原理。方法:1.选取50只雌性SD大鼠,体重250g-300g,分为三组,实验组A组15只,对照组B组15只,供血组C组20只,给予AB两组大鼠腹腔麻醉,右侧背部剃除3cm*3cm大小面积毛发,使用圆形铁块于酒精灯外焰灼烧15秒后立即紧密接触大鼠背部裸露皮肤,制造出直径1.5cm、深Ⅱ度烧伤创面,烧伤后给予创面碘伏消毒。2.C组取4只大鼠,腹腔麻醉后经腹腔静脉采血,每只采血约8ml,使用pp材质离心管盛放,取其中6ml于采血后60秒内离心(700转/3min),余下2ml用于血小板计数及VEGF浓度检测,离心后见采血管内血液分为两层,上层约2/5为淡黄色层,下层为红色层,抽取上层液体,即为目标制品IPRF,4只大鼠血液总共可制备约8ml IPRF。3.ELISA检测IPRF与全血内VEGF含量,镜下人工计数IPRF与全血内血小板含量。4.使用IPRF在A组大鼠烧伤创面行皮下注射,注射点位的选择分别为创面边缘对称4点,创面中心1点,共5点,进针深度约2-3mm,每个点注射0.1ml。5.使用生理盐水在B组大鼠烧伤创面行皮下注射(注射点位的选择及注射方法与A组相同)。6.大鼠造模后每5天从C组采用随机数法随机选取3只大鼠,腹腔采血后制备IPRF,A组大鼠创面注射IPRF,B组大鼠创面注射生理盐水(注射点位的选择及注射方法同前);大鼠造模后每5天拍照记录AB两组大鼠创面面积变化;并在AB两组内随机挑选3只大鼠予以处死,切取创周5mm范围内皮肤,进行实验室检测;于造模成功20天后停止处死大鼠,在AB两组各剩余大鼠中随机选取5只大鼠用于计算平均愈合时间与创面愈合率。7.造模成功20天后AB两组中未处死的剩余大鼠则待创面愈合率大于90%后处死,切取创周5mm范围内皮肤,用以实验室检测。8.实验过程中所切取组织,每份组织分为大小基本均一的两份,其中一份组织进行炎症因子及生长因子的检测,通过将组织研磨匀浆后取上清液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-6、IL-8、VEGF;第二份组织标本进行形态学检测,使用石蜡包埋切片,厚度4-6μm,免疫组化染色检测VEGF含量及分布,HE染色检测组织炎症细胞浸润程度,Masson染色检测胶原蛋白含量及分布,切片定量检测方法为采集显微图像后使用IMAGE J计算光密度值。结果:1.ELISA酶联免疫吸附法结果显示:测得IPRF内VEGF浓度高于血液内VEGF浓度,IPRF比血浆内血小板浓度高6倍余,说明在制备过程中,成功激活部分血小板,分泌出VEGF,证明IPRF制备成功,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。2.实验组(A组)与对照组(B组)创面组织匀浆,离心后取上清液行ELISA酶联免疫吸附法检测VEGF含量,结果显示:从造模第5天,实验组大鼠创面组织内VEGF含量高于对照组,两组VEGF浓度随实验过程上升,差异具有统计学意义(P<0.01);免疫组化染色显示实验组VEGF在创面组织血管内皮集中分布,对照组血管内皮无明显VEGF富集现象,IMAGE-j分析光密度值,AB两组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。3.实验组(A组)与对照组(B组)创面组织匀浆,离心后取上清液行ELISA酶联免疫吸附法检测IL6、IL8含量,结果显示:随实验进行,IPRF组与对照组内IL6、IL8浓度增加,实验组(A组)增长速度低于对照组(B组),AB两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。4.组织切片行HE染色,结果显示A组组织内炎症细胞计数低于B组,AB两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。5.组织切片行Masson染色,IMAGE-J计算结果显示:实验组(A组)胶原蛋白含量高于对照组(B组),实验组(A组)胶原蛋白分布均匀,结构清晰,对照组(B组)胶原蛋白含量较少,结构紊乱,两组胶原蛋白含量差异具有统计学意义(P<0.01)。6.创面愈合率:结果显示实验组(A组)高于对照组(B组),结果具有统计学意义(P<0.01),两组愈合时间差异无统计学意义。结论:1.IPRF可在一段时间内增加烧伤大鼠创面VEGF含量,促进组织内血管生长,促进肉芽组织形成。2.IPRF可降低大鼠烧伤创面炎症细胞浸润程度。3.IPRF降低创面组织炎性反应,创造更有利的愈合环境。4.IPRF促进创面向正常组织结构恢复。5.IPRF增加烧伤创面胶原蛋白产生,有效促进创面愈合。6.IPRF提高大鼠烧伤创面愈合率,缩短愈合时间,增加愈合质量。
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