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目的:1、构建携带人组织激肽释放酶基因(human kallikrein,HK)的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体,检测带有目的基因的重组AAV载体(rAAV/HK)滴度。2、体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC,将构建的rAAV/HK导入内皮细胞中,观察感染后内皮细胞一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(cNOS)的分泌情况。方法:1、试验一:在深圳市人民医院李体远博士合成的HK质粒基础上,扩增HK基因,用Xba I, EcoR I分别酶切HK基因和AAV-MCS质粒,然后连接HK和AAV-MCS的线性片断,形成重组腺相关病毒rAAV-HK质粒,经PCR检测和测序后,将rAAV-HK质粒与辅助质粒pHelper、pAAV-RC共转染到HEK293(人胚肾细胞)内包装成rAAV/HK载体,通过β-半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因pAAV-LacZ在人纤维肉瘤细胞(HT1080)中的表达,计算rAAV/HK载体病毒滴度。2、试验二:在相同条件下体外培养2组血管内皮细胞,一组用不同浓度携带目的基因的rAAV/HK(6.2×103mmol/l、6.2×104mmol/l、6.2×105mmol/l)的病毒液感染HUVEC,以硝酸还原酶法和一氧化氮合酶检测试剂盒分别检测48小时后HUVEC细胞培养液中NO的浓度值和cNOS活力,选取其中NO和cNOS表达最高的为HK干预组。另一组为单纯HUVEC细胞(对照组),同时分别检测对照组培养48小时后HUVEC细胞培养液中NO的浓度值和cNOS活力。结果:1、经PCR检测和测序证实rAAV/HK载体存在HK目的基因片断,其长度为800bp,说明rAAV/HK载体构建成功,rAAV/HK的滴度为6.2×107/ml。RT-PCR表明HK的表达有增加。2、病毒液浓度为6.2×103mmol/l的HUVEC细胞培养液中NO表达高于其他浓度值病毒液。与对照组相比,HK干预组细胞液中的NO、cNOS均增加。体外培养48小时后HK干预组细胞液NO浓度值和cNOS活力分别为40.16±7.61μmol/l和7.71±1.25U/ml;而对照组分别为30.82±3.07μmol/l和5.72±1.23U/ml。经SPSS10.0统计处理,48小时后2组差别具有显著性意义(P<0.05=。<WP=4>结论:本试验构建的rAAV/HK载体能将HK导入人血管内皮细胞,并使内皮细胞的NO、cNOS的分泌增多。本研究结果为今后激肽释放酶-激肽系统在人类高血压的基因治疗提供了理论依据。