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目的 大脑中动脉闭塞（MCAO）导致的缺血性脑疾病中，血脑屏障结构与功能发生病理改变，血循环中的炎性细胞及某些酶类毒性物质穿过血脑屏障进入脑内，使神经元受到致病因子的损伤导致其功能丧失，临床可引起偏瘫、偏身感觉障碍和偏盲等症状。近年研究表明，脑内神经细胞损伤时，损伤信号可向血液中的骨髓细胞传递，使骨髓间充质干细胞入脑并分化为神经元从而使神经组织得到修复和功能重建。具有修复神经损伤功能的骨髓间充质干细胞MSC是一小群存在于骨髓中的非造血成体干细胞，具有多向分化潜能，经体内、体外诱导后，均可检测到神经细胞特异性标志物，其取材方便，分离扩增容易，免疫源性弱，在适宜条件下，可作为细胞移植的供体用于神经疾病的治疗。 动物模型的研究证实，系统移植的骨髓间充质干细胞存在于移植受体的完整脑组织中，并以正确的方向分化，但经静脉注射的MSC如何通过血脑屏障迁移入脑目前仍不清楚，因此本实验在进行MSC穿过血脑屏障体内实验的同时，也将目光集中到MSC与血脑屏障体外模型即脑微血管内皮细胞相互作用的分子机制，从而为将来体外调控MSC高效特异穿过血脑屏障入脑发挥其修复神经损伤作用提供实验依据和理论基础。 在炎症疾病中，淋巴细胞、单核细胞等穿过普通毛细血管内皮主要分为聚集、滚动、粘附和跨血管内皮迁移等过程，这些过程也是表达在细胞表面的粘附分子相互识别和相互作用的结果，其中整合素α4与其配体VCAM-1结合介导细胞与血管内皮细胞发生稳定粘附是整个过程的关键环节。多发性硬化等疾病的研究发现，淋巴细胞和神经前体细胞在穿过血脑屏障时均表达Integrinα4。Integrinα4与其配体VCAM-1结合后，通过介导集中粘附区的FAK／Paxillin磷酸化，使细胞骨架重组，促进淋巴细胞或神经前体细胞的粘附和伸展，介导细胞活化并与内皮细胞发生稳定的粘附，从而启动其穿过血脑屏障向脑实质迁移。因此建立血脑屏障体外模型，分析MSC与体外模型中脑微血管内皮细胞接触后引起的各自细胞的Integrinα4／VCAM-1基因表达与蛋白质活性变化，具有一定理论和实践基础。 本研究旨在通过成体骨髓间充质干细胞静脉注射至脑缺血动物模型修复其神经损伤的体内实验及MSC与脑微血管内皮细胞相互作用后引起的各自细胞Inte护na4/vCAM一1基因表达与蛋白质活性变化的体外实验，探讨Inte幼na4一vcAM一1信号通路是否参与Msc穿过血脑屏障，从而对有效保护神经元及脑损伤后的组织修复和功能重建提供有利指导。方法 （一）体内实验: 1 .MSC的分离培养及鉴定 （l）无菌状态下取雄性大鼠骨髓细胞，体外分离、培养和扩增。 （2）免疫细胞化学方法检测MSC表面标志物CD45、CD90的表达。 2.大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血再灌动物模型的制备。 3.制备脑切片 （1） MSC经静脉注射移植人动物模型体内。 （2）脑组织灌流固定后制备冰冻切片。 4.制备Y染色体DNA探针及荧光标记 （l）提取雄性大鼠基因组DNA，PCR法扩增Y染色体特异性SRY基因DNA片段（459bv）。 （2）构建重组质粒pUCmT一SRY459。 （3）以重组质粒pUCmT一SRY459为模板，通过荧光素Cy3一dCTP参与PCR反应再次扩增SRY基因（305bp）片段作为DNA探针，使探针达到荧光标记。 5.脑细胞的三重荧光染色 （l）荧光原位杂交检测Y染色体表达。 （2）免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶（neulon一spec访。endolase，NsE）表达。 （二）体外实验: 1.MSC的分离培养。 2.血脑屏障体外模型的建立:培养和扩增人脑微血管内皮细胞（HB-MEC），使其长至单层形成紧密连接。3.MSC与脑微血管内皮细胞相互作用。4.RT一PCR法检测玩te幼na4和VCAM一l的表达。5.Western Blot法检测VCAM一1的表达。结果 （一）体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞 1.分离纯化后的MSC形态不均一，可呈现长梭形、大而扁平、小而多颗粒等多种形态。10一14天后形成克隆，约3周出现致密贴壁层。通过换液，MSC以外的造血细胞被去除，MSC自然纯化。 2.免疫细胞化学检测结果显示，所分离细胞为CD90阳性、CD45阴性，鉴定结果在第2一15代之间均无变化，说明分离纯化的细胞符合MSC的生物学特性。 （二）静脉注射MSC可修复脑缺血大鼠的神经损伤 1.实验组大鼠经尾静脉注射MSCI天后症状无改善，从第7天开始大鼠表现有可直线行走或自如转圈，提尾倒立时前肢可伸展等现象。随MsC移植时间延长，实验组大鼠神经损伤有所修复，而对照组大鼠基本无改变。 2.实验组大鼠随MSC移植时间延长“Homer”征症状有所改善，病灶侧眼裂大小和眼球逐渐恢复正常，而对照组大鼠症状无改善。 3.荧光原位杂交检测雄性大鼠脑切片Y染色体染色达so%一0%，而雌性大鼠未检测到Y染色体染色，说明本实验中所用的Y染色体pNA探针具有性别特异性。 4.脑细胞三重荧光染色结果显示，实验组MsC可穿过血脑屏障人脑（占脑组织细胞总数的2.6%），进人脑组织中的MSC可分化为神经元（占MSC总数的3 .9%）。 (?