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研究背景胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,为全球第四高发癌症,居我国癌症发病及死亡的第二位。因为早期胃癌无明显症状,并且国内胃癌预防筛查体系尚未建立,多数胃癌患者就诊时已到中晚期。化疗在临床上被广泛应用于胃癌围手术期治疗和姑息性治疗,但胃癌的原发耐药或多药耐药现象仍是影响胃癌患者总生存期和生存质量的主要因素之一。滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,Trop2/TACSTD2/M1S1/GA733-1)是最早发现于人类胎盘滋养层组织的一种单跨膜糖蛋白,能够调节细胞内钙离子浓度并影响MAPK、IGF-1R等信号通路。本实验室前期研究发现Trop2在胃癌组织中高表达并与患者预后密切相关。Trop2与CREB、P27等蛋白存在作用关联,可能对它莫西芬、吉西他滨等药物的治疗效果产生影响,但Trop2对胃癌细胞化疗耐药的作用及其机制尚不清楚。本研究通过构建Trop2 sh RNA稳定细胞株,观察Trop2对胃癌细胞化疗耐药的影响,并探讨其分子作用机制,为逆转胃癌化疗耐药提供理论依据。研究方法1.shRNA靶向干扰Trop2胃癌稳定细胞株的建立Western Blot检测Trop2在正常胃粘膜细胞GES-1和胃癌细胞MGC803、BGC823、MKN45、MKN28、HGC27、SGC7901中的表达情况;构建Trop2短发夹干扰RNA(sh RNA),选择Trop2相对高表达的胃癌细胞BGC823,应用慢病毒转染技术转导Trop2 sh RNA(标记为BGC823-sh Trop2)和空载体(标记为BGC823-sh NC);q RT-PCR、Western Blot和免疫荧光法检测Trop2在BGC823-sh Trop2和BGC823-sh NC细胞中的表达;Transwell细胞实验验证Trop2表达下调后胃癌细胞迁移和侵袭能力的改变。2.Trop2对胃癌细胞化疗耐药的影响CCK-8增殖试验检测顺铂和柔红霉素对细胞增殖影响的变化;流式细胞术和Hoechst 33342染色检测顺铂和柔红霉素对细胞凋亡影响的变化;建立异种移植瘤裸鼠模型,通过肿瘤生长曲线和组织学观察分析Trop2表达下调后顺铂对肿瘤生长抑制作用的变化;免疫组化验证裸鼠体内肿瘤组织中Trop2的表达情况。3.Trop2对胃癌化疗耐药性影响的机制研究qRT-PCR、Western Blot检测Trop2表达下调后耐药相关基因MRP1和TopoⅡα的m RNA和蛋白表达变化;Western Blot检测Notch1信号通路的变化。研究结果1.BGC823-sh Trop2细胞中Trop2 m RNA及蛋白表达水平较BGC823和BGC823-sh NC明显降低(P<0.05),BGC823-sh Trop2细胞迁移和侵袭能力较BGC823和BGC823-sh NC下降(P<0.05)。2.顺铂和柔红霉素对BGC823-sh Trop2细胞半数抑制浓度低于BGC823-sh NC,对BGC823-sh Trop2细胞的增殖抑制率明显高于BGC823-sh NC(P<0.05);顺铂或柔红霉素诱导的BGC823-sh Trop2细胞凋亡率显著高于BGC823-sh NC(P<0.05);体内实验,顺铂对BGC823-sh Trop2组肿瘤生长的抑制效果更加显著。3.Trop2表达下调后,BGC823-sh Trop2细胞中药物靶分子TopoⅡαm RNA和蛋白表达水平较BGC823-sh NC明显升高(P<0.05),药物转运分子MRP1m RNA和蛋白表达水平较BGC823-sh NC明显降低(P<0.05),MRP1上游调控通路Notch1蛋白水平较BGC823-sh NC明显降低(P<0.05)。研究结论1.成功建立sh RNA靶向干扰Trop2胃癌稳定细胞株BGC823-sh Trop2。2.Trop2能增强胃癌细胞对化疗药物的耐受性,减弱顺铂对体内肿瘤的抑制效果。3.Trop2能抑制TopoⅡα的表达,同时通过Notch1信号通路促进MRP1的表达,增强胃癌细胞的耐药性。