本研究以治疗中重度老年痴呆症药物盐酸美金刚(1,3-二甲基-5-氨基金刚烷盐酸盐)为研究对象,建立了能够满足生物基质中美金刚药物浓度测定的液质联用分析方法,并对其在大鼠体内吸收、分布、排泄过程特征和在我国健康男性、女性受试者体内的单剂量(低、中、高三种剂量)和多剂量给药后药物动力学行为特征进行了系统的研究。并采用UPLC-MS联用技术,运用代谢组学的研究方法,对老年痴呆患者和老年健康者对照组的血浆和尿液分别进行了代谢组学的研究,共发现14个生物标记物,研究结果为老年痴呆症的发病机制、诊断和临床研究提供了依据。1.盐酸美金刚在大鼠体内的药代动力学对大鼠血浆中美金刚药物浓度测定的前处理方法进行了研究。将新兴的浊点萃取技术应用于生物样品的预处理过程,建立了适合大鼠血浆中美金刚药物浓度测定的LC-MS方法；同时建立了基于液-液萃取技术,测定生物基质中美金刚药物浓度的LC-MS方法。两种方法的定量下限均为1 ng／mL,浊点萃取法和液-液萃取法的平均提取回收率分别为95.7%和85.4%。美金刚在生物基质中浓度测定方法的成功建立,为后期的研究提供了方法。应用所建立的分析方法对美金刚在大鼠体内的药动学行为进行了考察,分别以2.5mg／kg的剂量灌胃和尾静脉注射给予大鼠盐酸美金刚后,药物在动物体内的Cmax分别为183.4±36.6和243.1±79.9 ng／mL,AUC0-t分别为816±79和881±193 ng·h／mL,AUC0-∞分别为836±82和923±196 ng·h／mL,t1/2分别为4.56±0.73和4.78±1.08 h。由灌胃给药组和静脉注射给药组中的AUCo-t数据比值计算,得到药物的绝对生物利用度为92.6%。以2.5 mg／kg单剂量灌胃给予大鼠盐酸美金刚后,药物在动物体内各个组织器官的分布水平进行了考察。结果表明,美金刚在动物体内的分布迅速且广泛,给药后10min,各组织脏器中即可检测到较高的药物浓度,其中药理作用部位脑组织中能检测到较高浓度水平的药物浓度197.4±85.5 ng／g,说明该药物可以较高效率地透过血脑屏障,研究结果为本药物的临床应用提供了依据。由于以灌胃的方式给药,药物浓度的最大值出现在胃、小肠、肝脏等消化道主要器官中,浓度分别为86.7±18.8,15.01±8.78,9.64±2.18μg／g。除此之外,在肺、脾等血流充沛的组织中亦有大浓度的药物检出。研究中,以2.5 mg／kg单剂量灌胃给予大鼠盐酸美金刚,在给药后的0～72 h,对原型药物在动物体内的排泄过程进行了考察。原型药物在尿液中的累积排泄量为87.5±35.4μg,相当于给药量的15.9%；相同时间段内,随粪便排出的原型药物量为4.132±2.407μg,不足给药量的0.8%；药物在胆汁中的排泄平稳且缓慢,给药后0～16 h累计排泄量为885±495 ng,仅为给药量的0.15%,说明其在大鼠体内的肝肠循环现象十分微弱。研究结果表明,经各个排泄途径可检测到的原型药物量的总和低于给药剂量的17%,可见给予动物的盐酸美金刚绝大部分已被代谢掉,主要以代谢产物的形式排出体外。2.盐酸美金刚在健康人体内的药代动力学采用单次给药和多次给药的方式,通过测定血浆中美金刚的浓度,了解血药浓度的经时变化过程,估算相应的药代动力学参数,评价该制剂口服后人体药代动力学特征。单次给药后体内药代动力学30名健康志愿者随机分为低、中、高三个剂量组,每组10人,男女各半,分别单次口服盐酸美金刚片5 mg,10 mg,20 mg。低剂量组10名健康受试者口服5 mg该制剂后,男性、女性受试者的主要药代动力学参数如下：Tmax(h)分别为5.40±1.95和6.00±1.41,Cmax(ng／mL)分别为5.932±0.730和6.477±0.734,t/,2(h)分别为70.75±12.78和66.98±11.77,AUC0-t(ng·h／mL)分别为484.5±71.9和487.8±96.0,AUC0-∞(ng·h／mL)分别为535.5±95.9和544.6±94.1。中剂量组10名健康受试者口服10 mg该制剂后,男性、女性受试者的主要药代动力学参数如下：Tmax(h)分别为5.60±1.67和6.40±0.89,Cmax(ng／mL)分别为11.47±2.31和11.73±1.78,t1/2(h)分别为63.11±8.53和64.02±16.82 h,AUC0-t(ng·h／mL)分别为875±315和904±171,AUC0-∞(ng·h／mL)分别为922±303和942±167。高剂量组9名健康受试者(其中1名女性志愿者脱落)口服20 mg该制剂后,男性、女性受试者的主要药代动力学参数如下：Tmax(h)分别为6.80±1.79和7.00±1.16,Cmax(ng／mL)分别为26.07±7.82和24.42±10.65,t1/2(h)分别为60.86±12.78和63.57±4.43,AUC0-t(ng·h／mL)分别为1693±658和1873±1068,AUC0-∞(ng·h／mL)分别为1753±633和1978±1067。采用方差分析法和线性回归法对低、中、高剂量组健康受试者主要药代动力学参数分别进行检验分析,结果表明AUC0-t,AUC0-∞,Cmax均与剂量呈正相关,低、中、高三个剂量组美金刚的消除半衰期(t1/2)和Tmax经非参数检验没有显著性差异,即不随剂量的改变而变化,提示在5～20 mg剂量范围内,美金刚在健康受试者体内呈线性药代动力学特征。男性和女性健康受试者的主要药代动力学参数之间无显著性差异,提示性别差异不影响美金刚在体内单次给药的药代动力学过程。多次给药后体内药代动力学多次给药组为10名健康受试者,男女各半,以5 mg／d的剂量口服该制剂后,在给药第11 d即可达到稳态血药浓度；男性、女性受试者的主要药代动力学参数如下：Tmax(h)分别为6.00±2.00和7.60±2.97,Css max(ng／mL)分别为18.37±1.31和21.01±1.85,t1/2(h)分别为57.67±8.17和71.47±20.12,AUCss(ng·h／mL)分别为363.9±43.8和408.8±71.3,DF(%)分别为42.22±12.10和46.73±19.87,蓄积因子(R)为3.46±0.49和4.29±1.21,结果显示在应用该给药方案后,美金刚在体内有中度的蓄积,提示盐酸美金刚在长期服用时,应注意不良反应的产生。通过对上述单次给药和多次给药的健康受试者主要药代动力学参数分别进行检验分析,结果表明,单次给药与多次给药健康受试者的美金刚体内过程相近,经非参数检验,主要药代动力学参数Tmax和t1/2与单次给药的药代动力学参数基本一致(P>0.05),提示美金刚在体内的吸收、消除不随多次给药而发生变化。在多剂量组中除了男性受试者Css max低于女性受试者(P<0.05)外,男性和女性健康受试者的其他主要药代动力学参数均无显著差异。美金刚与人血浆蛋白结合率的研究采用平衡透析法结合LC-MS的检测方式,测定美金刚在透析外液和透析内液的药物浓度。对美金刚在健康人血浆中低、中、高3个浓度水平(5,20,80 ng／mL)的血浆蛋白结合率进行计算。结果表明美金刚在药物浓度小于20 ng／mL时,平均人血浆蛋白结合率为45.9%,而在血药浓度为80 ng／mL时,平均人血浆蛋白结合率显著性地降低至33.6%。结果提示：美金刚在体内药物浓度较大时,蛋白结合可能存在饱和现象。因此,当临床用药增大给药剂量,需注意血药浓度增大到一定程度时,游离的药物浓度相对于血浆药物浓度的比例增大,可能出现非线性药动学的特征,产生严重的不良反应。3.老年痴呆症的人体代谢组学采用UPLC-MS方法,对老年痴呆症患者的血浆和尿液分别进行了代谢组学研究。采集20名老年痴呆症患者和20名健康老年人的血浆,经沉淀蛋白预处理后,进行液质联用的分析；采集9名老年痴呆症患者(1名患者脱落)和10名健康老年人的尿液,经沉淀蛋白预处理后,进行液质联用的分析,得到的色谱图由MarkerLynx软件进行主成分分析(PCA),通过统计学的计算,根据变量的不同,确认生物标记物。对正常组和老年痴呆组血浆或尿液进行PCA分析得到的Score图中,两组之间由于在二维平面上的位置不同而较为明显地区分开来,两组的边界比较清晰,较少的部分重叠。在血浆样品的分析中发现并鉴定了9个生物标记物,分别是5个溶血卵磷脂(LPC C16:0, LPC C18:2, LPC C18:1, LPC C18:0, LPC C20:4),3个神经鞘氨醇(Phytosphingosine, Dihydrosphingosine, C16 dihydrosphingosine)和色氨酸,其中8个属于脂类。在尿液中发现9个生物标记物,鉴定了其中的8个,分别是6个神经鞘氨醇C14dihydrosphingosine(DHS),C16 DHS,C18 DHS,C20 DHS, Phytosphingosine, C20 phytosphingosine,色氨酸,肌酐和一个m／z 402.2的未知化合物。其中有4个生物标记物(3个鞘氨醇和色氨酸)是血液和尿液中所共有的。针对这些生物标记物,分别对老年痴呆症的机制进行了阐述：老年痴呆症患者的血浆中溶血卵磷脂的变化可能与脑部磷脂的分解和合成相关；鞘氨醇类物质的变化与脑部神经酰胺的代谢有着密切的联系；色氨酸主要经犬尿氨酸代谢途径代谢,代谢产物与老年痴呆症相关。将此结果与最近2009年美国专利(United States Patent:US 2009/0029473A1, Lipid profile as a biomarker for early detection of neurological disorders, Washington University in ST.LOUIS,MO(US))进行对比,支持了该专利中有关脂类的轮廓图,涉及到近千个脂类化合物,能作为神经障碍早期诊断的标记物的结论,更重要的是,其中几个具体的生物标记物在体内含量的变化趋势,这是该专利中没有体现的,而且专利中没有关于尿液的相关研究。本研究关于老年痴呆症相关生物标记物的发现,有利于此种疾病的发病机制、诊断和临床研究。