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小麦叶锈菌是专化性非常强的活体营养型真菌,在不亲和组合中寄主细胞过敏性反应(HR)是小麦抵抗叶锈菌侵染的重要防卫反应。γ-氨基丁酸(GABA)是一个四碳非蛋白质氨基酸,是普遍存在于生物体内的一类小分子物质。近年来的研究发现,GABA在植物生长、发育及胁迫适应等方面发挥着重要作用。在前期工作中,我们通过分析小麦与叶锈菌互作的转录组数据,筛选到GABA旁路中的TaGAD及TaSSADH在不亲和组合及亲和组合中表达差异均非常明显。在此基础上本研究以小麦近等基因系TcLr26及其轮回亲本Thatcher(Tc)分别与叶锈菌小种260组成不亲和组合及亲和组合,从GABA旁路的2个关键基因TaGAD和TaSSADH入手,探讨GABA旁路是否参与调控小麦抵抗叶锈菌侵染的HR发生过程。获得的主要试验结果如下:
1.利用RT-qPCR技术检测TaGAD和TaSSADH在不亲和及亲和组合中接种后不同时间的表达特征。结果显示TaGAD和TaSSADH的表达在不亲和组合接种后早期(4,8,12h)没有变化,从接种后16-72h伴随着HR的发生均被诱导表达;而在亲和组合中TaGAD只在接种后8-12h表达有所增加,TaSSADH没有明显变化。这一结果提示我们在不亲和组合中寄主GABA旁路被激活,而且可能与HR的发生有关。
2.利用SYKAM游离氨基酸分析仪S-433D测定了不亲和及亲和组合中GABA的含量变化。在不亲合组合中,GABA含量在接种后24h开始增加,到接种后72h为0h的3.8倍,而在亲和组合中GABA含量没有明显变化。这进一步表明在不亲和中,GABA旁路处于激活状态,可能与HR的发生紧密相关。
3.构建TaGAD和TaSSADH的亚细胞定位融合表达载体,瞬时转化烟草观察发现TaGAD主要定位于细胞质,TaSSADH则定位于线粒体。
4.利用VIGS技术和RNAi技术分别沉默TaGAD基因后,再接种叶锈菌小种260。与对照相比单侵染点寄主HR面积均有所减小,但叶锈菌吸器母细胞数没有明显差异。利用VIGS技术和RNAi技术分别沉默TaSSADH基因后,与对照相比单侵染点寄主HR面积均明显减小,而且RNAi-TaSSADH阳性植株菌丝扩展非常明显,接种14天后叶片表面可以看到明显的夏孢子堆。
综上结果表明GABA旁路在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR发生中发挥重要作用。
1.利用RT-qPCR技术检测TaGAD和TaSSADH在不亲和及亲和组合中接种后不同时间的表达特征。结果显示TaGAD和TaSSADH的表达在不亲和组合接种后早期(4,8,12h)没有变化,从接种后16-72h伴随着HR的发生均被诱导表达;而在亲和组合中TaGAD只在接种后8-12h表达有所增加,TaSSADH没有明显变化。这一结果提示我们在不亲和组合中寄主GABA旁路被激活,而且可能与HR的发生有关。
2.利用SYKAM游离氨基酸分析仪S-433D测定了不亲和及亲和组合中GABA的含量变化。在不亲合组合中,GABA含量在接种后24h开始增加,到接种后72h为0h的3.8倍,而在亲和组合中GABA含量没有明显变化。这进一步表明在不亲和中,GABA旁路处于激活状态,可能与HR的发生紧密相关。
3.构建TaGAD和TaSSADH的亚细胞定位融合表达载体,瞬时转化烟草观察发现TaGAD主要定位于细胞质,TaSSADH则定位于线粒体。
4.利用VIGS技术和RNAi技术分别沉默TaGAD基因后,再接种叶锈菌小种260。与对照相比单侵染点寄主HR面积均有所减小,但叶锈菌吸器母细胞数没有明显差异。利用VIGS技术和RNAi技术分别沉默TaSSADH基因后,与对照相比单侵染点寄主HR面积均明显减小,而且RNAi-TaSSADH阳性植株菌丝扩展非常明显,接种14天后叶片表面可以看到明显的夏孢子堆。
综上结果表明GABA旁路在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR发生中发挥重要作用。