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START(the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)结构域是含有200个氨基酸左右的序列,在植物、动物及细菌中都广泛存在含有编码START保守结构域的基因。已有报道表明植物中START结构域往往辅助其它结构域共同调控着植物的生长发育,但生物信息学分析表明拟南芥能编码START结构域蛋白的基因共有35个,除与HD、HD-ZIP、HD-ZLZ等结构域共同存在的START结构域家族成员外,还有9个仅含START结构域的亚家族成员,对这些成员功能的分析有助于人们对START结构域功能的认知。我们前期工作已对仅含START结构域的4个成员进行了生物学功能分析,这些基因有着各自不同的时空表达特性,参与到不同的逆境胁迫和生长发育调控中。
拟南芥PCST5(由At5g54170编码)是拟南芥START结构域蛋白家族中的第5个成员,其在调控植物生长发育方面的功能未知,本研究对PCST5的功能和作用机制进行分析,对深入阐明START结构域的功能及其在植物生长发育过程的调控中具有重要理论和应用价值。
通过生物信息学分析可得知,PCST5基因的片段总长度为1350bp,位于拟南芥第5条染色体上,编码共含有449个氨基酸的蛋白质,该蛋白质仅含有一个START结构域,结构域内有磷脂酸胆碱的结合位点,PCST5编码的蛋白质具有两个跨膜的片段。这为我们研究其功能提供了重要的参考价值。
PCST5的表达模式分析
(1)PCST5时空表达特性:PCST5主要在拟南芥的幼苗期表达,子叶、真叶以及根中有较多的表达,叶片中主要在叶脉中表达,随着发育时间的延长,在叶和根中的表达降低,成苗期主要分布在叶柄基部和花器官的花药中表达,同时在花瓣和萼片的表达量也较少。
(2)PCST5的亚细胞定位:PCST5定位在细胞质膜上。
PCST5的生物学功能分析
通过创制PCST5的功能获得和缺失的转基因拟南芥,对其表型和抗逆性进行分析,结果表明PCST5参与拟南芥的抽薹开花和逆境的调控:
(1)PCST5对拟南芥花期的调控。
与野生型拟南芥相比,过表达PCST5的转基因植株抽薹时间提前4d左右。为研究其调控拟南芥开花的分子机制,本研究分析了PCST5对开花关键基因SPY、FLC(FLO WERING LOCUS C)、CO(CONSTANS)、FT(FLOWERING LOCUST)、LFY(LEAFY)的表达量的影响,抑制开花的SPY和FLC基因的表达,促进FT、LFY基因的表达,从而促进提前抽薹开花。
(2)PCST5对拟南芥抗逆性的调控。
由于PCST5的START结构域内具有磷脂酰胆碱结合位点,而且知道磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分,因此START结构域可能影响细胞膜的稳定性,参与调控拟南芥的抗逆反应。研究发现,在渗透胁迫(NaCl和甘露醇处理)下,PCST5和T-DNA插入突变体的种子萌发均受到轻微抑制,但幼苗耐渗透胁迫能力增强。在热和冷冻胁迫(45℃和-7℃)条件下,PCST5和T-DNA插入突变体抗热和冷的能力高于野生型拟南芥。说明PCST5在拟南芥不同时期及相应不同的胁迫信号具有不同的作用机制。
为明确PCST5参与调控拟南芥抗渗透胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥盐诱导关键基因SOS1、NHXI以及与细胞膜稳定性相关的FAD2基因。和其它株系相比,发现PCST5过表达突变体和T-DNA插入突变体中SOS1变化不明显,而NHXI的表达量呈现下降的趋势,说明PCST5可通过间接调控上述相关基因的表达来调控拟南芥的耐渗透胁迫能力。同时测定其相对电导率的变化情况,过表达株系的电导率值相对较高。
为明确PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥热诱导关键基因(热激蛋白转录因子)HsfA1e、HsfA1α、HsfA1b、HsfA1d和冷胁迫关键基因P5CS1表达量的影响。结果表明,PCST5表达量升高后明显诱导HsfA1e、Hsf1α、HsfA1b、HsfA1d的表达量,并且促进P5CS1的表达,此为PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制提供了理论基础。
综上所述,本论文明确了PCST5的时空表达特性;确定了其参与拟南芥种子萌发、抽薹开花和逆境调控方面的功能;分析了PCST5对拟南芥抽薹开花、盐、干旱、冷、热信号转导途径关键基因表达量的影响,对深入分析PCST5调控拟南芥生长发育的作用机理具有重要的意义。
拟南芥PCST5(由At5g54170编码)是拟南芥START结构域蛋白家族中的第5个成员,其在调控植物生长发育方面的功能未知,本研究对PCST5的功能和作用机制进行分析,对深入阐明START结构域的功能及其在植物生长发育过程的调控中具有重要理论和应用价值。
通过生物信息学分析可得知,PCST5基因的片段总长度为1350bp,位于拟南芥第5条染色体上,编码共含有449个氨基酸的蛋白质,该蛋白质仅含有一个START结构域,结构域内有磷脂酸胆碱的结合位点,PCST5编码的蛋白质具有两个跨膜的片段。这为我们研究其功能提供了重要的参考价值。
PCST5的表达模式分析
(1)PCST5时空表达特性:PCST5主要在拟南芥的幼苗期表达,子叶、真叶以及根中有较多的表达,叶片中主要在叶脉中表达,随着发育时间的延长,在叶和根中的表达降低,成苗期主要分布在叶柄基部和花器官的花药中表达,同时在花瓣和萼片的表达量也较少。
(2)PCST5的亚细胞定位:PCST5定位在细胞质膜上。
PCST5的生物学功能分析
通过创制PCST5的功能获得和缺失的转基因拟南芥,对其表型和抗逆性进行分析,结果表明PCST5参与拟南芥的抽薹开花和逆境的调控:
(1)PCST5对拟南芥花期的调控。
与野生型拟南芥相比,过表达PCST5的转基因植株抽薹时间提前4d左右。为研究其调控拟南芥开花的分子机制,本研究分析了PCST5对开花关键基因SPY、FLC(FLO WERING LOCUS C)、CO(CONSTANS)、FT(FLOWERING LOCUST)、LFY(LEAFY)的表达量的影响,抑制开花的SPY和FLC基因的表达,促进FT、LFY基因的表达,从而促进提前抽薹开花。
(2)PCST5对拟南芥抗逆性的调控。
由于PCST5的START结构域内具有磷脂酰胆碱结合位点,而且知道磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分,因此START结构域可能影响细胞膜的稳定性,参与调控拟南芥的抗逆反应。研究发现,在渗透胁迫(NaCl和甘露醇处理)下,PCST5和T-DNA插入突变体的种子萌发均受到轻微抑制,但幼苗耐渗透胁迫能力增强。在热和冷冻胁迫(45℃和-7℃)条件下,PCST5和T-DNA插入突变体抗热和冷的能力高于野生型拟南芥。说明PCST5在拟南芥不同时期及相应不同的胁迫信号具有不同的作用机制。
为明确PCST5参与调控拟南芥抗渗透胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥盐诱导关键基因SOS1、NHXI以及与细胞膜稳定性相关的FAD2基因。和其它株系相比,发现PCST5过表达突变体和T-DNA插入突变体中SOS1变化不明显,而NHXI的表达量呈现下降的趋势,说明PCST5可通过间接调控上述相关基因的表达来调控拟南芥的耐渗透胁迫能力。同时测定其相对电导率的变化情况,过表达株系的电导率值相对较高。
为明确PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制,本研究分析了PCST5对拟南芥热诱导关键基因(热激蛋白转录因子)HsfA1e、HsfA1α、HsfA1b、HsfA1d和冷胁迫关键基因P5CS1表达量的影响。结果表明,PCST5表达量升高后明显诱导HsfA1e、Hsf1α、HsfA1b、HsfA1d的表达量,并且促进P5CS1的表达,此为PCST5调控拟南芥抗热和冷胁迫能力的分子机制提供了理论基础。
综上所述,本论文明确了PCST5的时空表达特性;确定了其参与拟南芥种子萌发、抽薹开花和逆境调控方面的功能;分析了PCST5对拟南芥抽薹开花、盐、干旱、冷、热信号转导途径关键基因表达量的影响,对深入分析PCST5调控拟南芥生长发育的作用机理具有重要的意义。