论文部分内容阅读
本研究中,采用乳化-溶剂挥发法和共孵育法制备了聚多巴胺（PDA）包裹聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒,并接枝靶向配体叶酸（FA）和长循环高分子聚乙二醇（PEG）,以此负载阿霉素（DOX）构建了一种具有肿瘤靶向和光热响应性的新型纳米载体系统DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA。该载药系统利用叶酸配体的肿瘤靶向性和PEG的长循环作用提高了DOX的抗肿瘤效果并结合聚多巴胺的光热效应为肿瘤的化疗和光热治疗提供多样性选择。采用正交试验优化DOX-PLGA纳米粒的制备工艺,当药载比为1:5,油水比为1:10,300W超声5min,三乙胺用量为10μl,PVA浓度为1%,丙酮为溶剂时,DOX-PLGA纳米粒具有最佳的包封率86.55%和载药量16.98%。通过共孵育法制备了包被PDA和配体修饰的DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒,正交实验结果表明,当孵育比（DOX-PLGA:DA）为1:5,孵育时间为10h,孵育pH为8.0,DOX投药量为0.5mg时,DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA具有最佳的包封率和载药量。通过红外光谱（FT-IR）法、X射线衍射法（XRD）和紫外分光光度法（UV）对DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒进行表征。通过分析测定粒径与粒度分布、表面电位和透射电镜（TEM）对不同DOX纳米制剂的形态进行表征同时考察了纳米粒的稳定性和溶血实验。采用体外溶出实验考查不同DOX纳米制剂的体外释放行为和响应性特征。FT-IR、XRD和UV结果表明多巴胺可发生聚合并成功孵育PLGA纳米粒表面。TEM结果表明DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒为球形颗粒,平均粒径为130.4nm,表面带负电（-15.11mv）。纳米粒稳定性较好,经高速离心后药物泄漏率低于10%,4°C冷藏35天内,纳米粒的粒径、PDI和电位无明显变化。近红外激光照射实验表明,DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒具有较好的光热效应,其升温幅度具有时间依赖性。体外释放实验表明该纳米粒在酸性、氧化性（过氧化氢,H2O2）和还原性（谷胱甘肽,GSH）介质中具有多重响应特性,可促进药物的快速释放。大鼠体内药动学结果显示,DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒组的AUC0→t为17.29μg·h/ml,MRT0→t为14.87h,Cmax为11.81μg/ml,t1/2为18.93h,分别是DOX组的15.86倍,8.4倍,8.2倍,8.88倍。组织分布结果显示DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒提高了药物在肝脏、脾脏和肾脏中的分布,且12h后仍然保持较高的浓度水平。MTT结果表明DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒对HepG2细胞具有最强的生长抑制作用,IC50为0.756μg/ml,当纳米粒配合近红外激光照射后,IC50进一步下降为0.288μg/ml。叶酸抑制实验表明DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒可通过配体受体特异性结合作用被HepG2细胞摄取,此外摄取过程还受到网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用调控。细胞凋亡检测结果表明纳米粒主要作用于HepG2细胞周期中的S期（DNA复制期）。经近红外激光照射DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米能显著提高HepG2细胞的活性氧水平,增加细胞对化疗药物的敏感度。建立了BALB/c小鼠的H22肝癌模型,对不同DOX纳米制剂的体内药效进行初步评价。结果显示,DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA实验组表现出最佳的抗肿瘤效果。与其他DOX制剂实验组相比,该纳米药物可改善炎症因子IL-6和TNF-α的水平含量,降低DOX相关的毒副作用,与HE染色结果相符,同时可有效靶向至肿瘤组织并在近红外激光刺激下迅速升温,改善化疗药物的肿瘤治疗效果。综上所述,DOX-PLGA@PDA-DOX/PEG/FA纳米粒制备工艺稳定,安全性好,可延长药物在体内的循环时间,降低毒性,提高在肿瘤组织的富集,同时将化疗和光热治疗相结合,为肿瘤的多手段联合治疗提供了参考。