论文部分内容阅读
目的:探讨lncRNA LINC01606对结肠癌细胞生物学功能的作用及机制研究。方法:1)采用在线TCGA数据库Driver DBv3分析LINC01606在结肠癌中的表达情况,并分析其在结肠癌中的表达水平及与预后之间的关系。采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）进一步检测LINC01606在83对结肠癌组织和癌旁组织中的表达水平,结合临床病理资料分析LINC01606与结肠癌的临床病理特征的关系,并采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）分析其临床诊断价值。使用qRT-PCR检测LINC01606在5个结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞系中的表达水平。2)采用慢病毒构建LINC01606干扰和过表达载体并建立LINC01606干扰和过表达及相应对照载体的稳定细胞株。通过荧光显微镜观察慢病毒载体感染后荧光细胞比例和qRT-PCR检测LINC01606表达水平验证感染效率。干扰和过表达LINC01606后,采用CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验检测LINC01606对结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和生长的影响。3)采用qRT-PCR检测球细胞与贴壁细胞LINC01606的表达水平。用流式细胞仪分选出CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞,qRT-PCR检测CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞LINC01606的表达水平。干扰和过表达LINC01606后,采用成球实验检测LINC01606对结肠癌细胞体外成球能力的影响;使用流式细胞仪分析LINC01606对CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞比例的影响;使用qRT-PCR检测LINC01606对干性标志物CD44、CD133、Nanog、Sox2、Epcam和Lgr5表达水平的影响;CCK-8实验和细胞流式实验检测LINC01606对结肠癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）敏感性。4)使用铁死亡诱导剂或者抑制剂处理细胞后,采用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察细胞形态学变化及CCK-8检测细胞活性变化;干扰和过表达LINC01606并使用铁死亡诱导剂处理细胞后,观察细胞形态学、细胞活性、细胞内Fe2+及总铁、线粒体超氧化物、脂质活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及线粒体膜电位的变化情况。5)采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测LINC01606在SW480和HT29细胞中表达分布情况。生物学信息分析miR-423-5p可能与LINC01606和SCD1及Wnt3a结合;荧光素酶实验检测LINC01606、SCD1和Wnt3a与miR-423-5p的结合情况;采用RNA Pull down和Ago2-RIP实验检测miR-423-5p与LINC01606和SCD1的直接结合关系;干扰和过表达LINC01606或miR-423-5p后检测SCD1及LINC01606的表达水平。6)干扰和过表达LINC01606或miR-423-5p后检测Wnt信号分子:Wnt3a、β-catenin、EP300、TCF7、LEF1和c-Myc表达水平;采用Topflash/Fopflash实验检测LINC01606与Wnt/β-catenin信号之间的关系;使用Wnt信号抑制剂C59和激活剂BML-284及联合干扰和过表LINC01606处理细胞后,检测LINC01606、SCD1及Wnt信号分子的表达水平。7)采用LINC01606启动子DNA pull down实验筛选出与Wnt信号相关的转录因子TFE3;在TCGA数据库及83对结肠癌组织中分析TFE3在结肠癌中的表达水平;过表达TFE3后检测LINC01606的表达水平。使用Jasper数据库预测TFE3与LINC01606启动子的结合位点,并根据结合位点构建野生型和突变型荧光素酶载体,荧光素酶实验验证TFE3与LINC01606启动子区域的结合关系。通过ENCODE数据库和Chi P-seq实验分析TFE3在LINC01606启动子区域的富集信号值。8)联合使用铁死亡诱导剂、Wnt信号抑制剂和激动剂、过表达LINC01606处理细胞后,检测细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS的浓度以及线粒体膜电位的变化情况。使用铁死亡诱导剂处理CD44+CD133+和CD44-CD133-细胞后检测细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS的浓度以及线粒体膜电位的变化情况。9)干扰LINC01606使用RSL3处理细胞后,采用气相色谱-质谱联用仪（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）检测40种中长链游离脂肪酸的浓度变化以及分析饱和脂肪酸（saturated fatty acids）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids）、多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids）浓度比例情况变化。结果:1)LINC01606在TCGA数据库和83对结肠癌组织中表达增高;其表达水平与肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移、TNM分期和Ki-67表达丰度显著相关;生存分析发现高表达LINC01606的结肠癌患者生存期（overall survival,OS）、无进展间隔期（progression free interval,PFI）、无病间隔期（disease free interval,DFI）明显低于低表达LINC01606的结肠癌患者;ROC曲线分析发现LINC01606作为结肠癌组织中的诊断标志物,其曲线下面积为0.725,诊断结肠癌的敏感性为54.22%,特异性为84.34%;LINC01606的表达水平在结肠癌细胞中的表达水平明显高于正常肠上皮细胞,并且在HT29和SW480中表达水平最高。2)观察各组绿色荧光的细胞比例均大于90%;干扰LINC01606能降低结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和生长的能力;过表达LINC01606能增加结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移和生长的能力。3)LINC01606在球细胞中的表达水平高于贴壁细胞,并且在CD44+CD133+细胞中的表达水平显著高于CD44-CD133-细胞;干扰LINC01606后细胞的成球能力、CD44+CD133+细胞比例、对化疗药物5-Fu的耐受性下降以及下调干性标志物CD44、CD133、Nanog、Sox2、Epcam和Lgr5;而过表达LINC01606后细胞成球能力、CD44+CD133+细胞比例、对化疗药物5-Fu的耐受性增强以及上调干性标志物CD44、CD133、Nanog、Sox2、Epcam和Lgr5。4)铁死亡诱导剂Erastin和RSL3能够诱导结肠癌细胞发生典型的铁死亡形态学变化,并且能够明显抑制细胞活性,而铁死亡抑制剂Fer-1能够缓解Erastin和RSL3对细胞活性的抑制。干扰LINC01606能够加重细胞的损伤,降低细胞活性,增加细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS的浓度以及降低线粒体膜电位;过表达LINC01606能够减轻细胞的损伤,增加细胞活性,降低细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS的浓度以及增加线粒体膜电位;5)LINC1606在细胞质和细胞核均有分布,其主要分布在细胞质;荧光素酶实验提示miR-423-5p可直接调控LINC01606和SCD1,不能调控Wnt3a;RNA pull down和Ago2-RIP实验进一步验证miR-423-5p可以直接结合LINC01606和SCD1;干扰LINC01606能够下调SCD1的表达,过表达LINC01606能够上调SCD1的表达;过表达miR-423-5p下调SCD1和LINC01606的表达,干扰miR-423-5p上调SCD1和LINC01606的表达;6)干扰LINC01606及过表达miR-423-5p后能降低Wnt/β-catenin信号的活性,而过表达LINC01606及干扰miR-423-5p后能够增加Wnt/β-catenin信号的活性;Topflash/Fopflash实验提示LINC01606能够通过β-catenin介导的TCF/LEF转录活性水平的调控;Wnt信号抑制剂C59能够下调LINC01606、SCD1和Wnt/β-catenin信号分子的表达水平;而Wnt信号激动剂BML-284能够增加LINC01606、SCD1和Wnt/β-catenin信号分子的表达水平;干扰LINC01606后能够抑制Wnt信号激动剂BML-284对Wnt信号的活化,而过表达LINC01606后能够缓解Wnt信号抑制剂C59对Wnt信号的抑制。7)LINC01606启动子DNA pull down提示有116个核蛋白与LINC01606启动子区域结合,并从中筛选出与Wnt信号相关的转录因子TFE3;TFE3在结肠癌组织中表达升高,与LINC01606表达水平呈正相关关系;过表达TFE3能够明显增加LINC01606的表达水平;荧光素酶实验及Chi P-seq实验证实TFE3能够作用于LINC01606的启动子。8)Wnt信号抑制剂C59能够增强RSL3诱导的细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS浓度的增加及增强RSL3诱导的线粒体膜电位的下降;Wnt信号激动剂BML-284能够缓解RSL3诱导的细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS浓度的增加及缓解RSL3诱导的线粒体膜电位的下降;过表达LINC01606能够缓解Wnt信号抑制剂C59对RSL3诱导的细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS浓度的增加及RSL3诱导的线粒体膜电位的下降。在CD44+CD133+细胞中,Erastin和RSL3诱导的细胞内Fe2+、总铁离子、线粒体超氧化物、脂质ROS浓度低于CD44-CD133-细胞,线粒体膜电位高于CD44-CD133-细胞。9)在SW480和HT29细胞中敲减LINC01606后,总共有17中脂肪酸出现改变,变化程度大于1μg/10~7有9种,其中7种脂肪酸浓度增加而2种脂肪酸浓度降低;干扰LINC01606后能过增加SFAs和PSFAs的浓度,降低MUFAs的浓度;并且干扰LINC01606后能过增加棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）的浓度,而降低棕榈烯酸（C16:1n7）和油酸（C18:1n9）的浓度,增加C16:0/C16:1n7和C18:0/C18:1n9比例。结论:本研究结果提示LINC01606可能通过SCD1-Wnt/β-catenin-TFE3正反馈信号抑制肿瘤细胞铁死亡,从而促进肿瘤细胞的“干性”和介导肿瘤的发生发展。