目的:为进一步了解布鲁菌致病机制,本研究应用体内诱导抗原技术（IVIAT）,筛选布鲁菌特异性体内诱导抗原,验证其免疫原性,并初步分析其在布鲁菌的胞内生存发挥的作用。从而为布鲁菌感染机制的研究提供新思路。方法:（1）实验建立布鲁菌基因组表达文库,以处理后的血清作为探针,利用IVIAT技术的特点,对布鲁菌表达文库进行特异性筛选布鲁菌16M株与S2疫苗株的差异性体内诱导抗原基因。（2）运用PCR技术从16M基因组中扩增DK63₄26和DK63₁0基因,连接pMD19-T载体,经酶切后构建重组表达质粒pET-28a-DK63₄26（DK63₁0）,转化到E.coli BL21（DE3）中后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后Western Blot检测其反应原性,与实验室收集的各18份布鲁菌16M羊血清、S2血清、阴性血清逐一进行Western Blot检测,统计各蛋白的阳性率。（3）以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK63₄26、DK63₁0基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,应用基因重组技术构建布鲁菌16M缺失株16MADK63₄26和16MADK63₁0,观察布鲁菌亲本株16M和16MADK63₄26、16MADK63₁0的生长变化趋势,侵染巨噬细胞,检测亲本株和缺失株在胞内的生存能力,检测其IL-6、TNF-α细胞因子释放量,对其LPS进行提取,Western-blot检测。结果:（1）从大小为3 417 183 bp布鲁菌16M基因组,得到覆盖率为95%,克隆插入率为97%,片段大小集中在500～5 000 bp,库容量为2.5 × 104个的基因组表达文库中,筛选到5个布鲁菌16M特异性体内诱导表达抗原基因。（2）PCR扩增DK63₄26和DK63₁0基因分别在1598 bp、1257 bp的位置出现条带;诱导表达和纯化后的SDS-PAGE显示DK63₄26和DK63₁0融合蛋白分别在63 KD和53 KD处;DK63₄26和DK63₁0仅与布鲁菌16M羊血清发生免疫反应,Western Blot检测出现杂交条带;生物信息学分析DK63₄26、DK63₁0基因与LPS的合成有关。（3）成功构建了 16MADK63₄26和16MADK63₁0;在体外相同培养条件下该缺失株与亲本株生长趋势相似,培养12 h即进入对数生长期,30h进入平台期;16MADK63₄26在侵染RAW264.7细胞12 h胞内存活率显著低于亲本株（P<0.01）,在侵染8h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株（P<0.05）,TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株（P<0.05）,在侵染12h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株（P<0.01）,TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株（P<0.01）。16MADK63₁0在侵染RAW264.7细胞12 h到24 h胞内存活率显著低于亲本株（P<0.01）,在侵染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株（P<0.05）;TNF-α的分泌量缺失株均显著高于亲本株（P<0.05）,在侵染12 h时IL-6的分泌量ADK63₁0组均极显著低于亲本株（P<0.05）;TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株（P<0.01）,到24 h缺失株组均极显著低于亲本株（P<0.05）;TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株（P<0.01）,在突变株中,缺失了完整的LPS结构,虽然缺失OPS的部分梯状条带,但仍然能检测到OPS。结论:（1）应用IVIAT技术,成功筛选到5个布鲁菌16M特异性体内诱导表达抗原基因。（2）成功克隆并表达DK63₄26和DK63₁0蛋白,证实其具有良好的反应原性且特异性表达,这与IVIAT免疫筛选技术结果是一致的,可为布鲁菌的诊断提供靶点。（3）DK63₄26（DK63₁0）基因的缺失可影响布鲁菌的胞内存活,影响相关炎症因子的表达,为布鲁菌感染机制的研究奠定理论基础。