粘液表皮样癌是一种常见的涎腺恶性肿瘤，其中低分化型肿瘤具有侵袭性强、转移率高、预后差的特点。目前，治疗低分化型粘液表皮样癌仍以外科手术为主，并辅以放疗或化疗，然而，临床疗效不令人满意。因此，很有必要探索新的治疗手段。近年来兴起的基因治疗为肿瘤治疗提供了新的途径。抑癌基因替代疗法是肿瘤基因治疗的有效策略之一，p53抑癌基因已用于恶性肿瘤的临床治疗试验。PTEN (phosphatase and tensin homology deleted onchromosome 10)基因是近年来发现的一种新的抑癌基因，许多研究表明，将野生型PTEN基因导入脑胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞，产生显著的抑癌效应，有望成为治疗肿瘤的候选基因。目前，尚未见有关涎腺粘液表皮样癌基因治疗研究的报道。本实验研究以高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2为研究对象，首次探讨外源性野生型PTEN抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞生物学行为的影响，主要研究方法和结果包括以下几个方面： 1．稳定表达外源性PTEN抑癌基因的高转移性粘液表皮样癌细胞系的建立免疫组织化学染色结果显示涎腺粘液表皮样癌、腺样囊性癌、舌癌、口底癌、颊癌等8例细胞系中有3例PTEN蛋白表达缺失，1例为颊癌细胞系，另2例为高转移性粘液表皮样癌和高转移性舌癌细胞系，提示PTEN蛋白表达缺失与其高转移特性有一定关系。应用脂质体介导方法野生型PTEN抑癌基因导入高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2，经嘌呤霉素筛选，免疫印迹试验和免疫 京口军巴大学派士学位论文－3．组化染色证实，转基因细胞稳定表达外源性野生型PTEN蛋白，细胞命名为M3 SPZ－PIFN，该细胞为粘液表皮样癌的抑癌基因替代疗法研究提供了实验模型。转染空白载体的对照细胞命名为M3SPZ下Bp。 2．PTEN抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞系生长的影响 应用光镜和电镜观察、细胞生长曲线测定、软琼脂克隆测定、裸鼠异种移植等方法，发现外源性野生型PTEN抑癌基因能够有效抑制高转移性粘液表皮样癌细胞体外和裸鼠体内生长。M3 SPZF 细胞生长缓慢，分裂相很少，细胞数量少、体积较大，部分细胞空泡变性，细胞膜彭出，细胞表面微绒毛少，线粒体数量少并发生肿胀，较多的溶酶体融合，染色质凝集，体外培养第3、5、7d细胞生长抑制率分别为57刀5％、62尸6％和刀．46％，分裂指数为16二％O，克隆形成抑制率为 72刀％，棵鼠移植瘤抑制率达 63．82％，与对照细胞 M3 SPZ比较有极显著性差异（P＜o．01）。 3．PTEN抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞抑制机理的研究 流式细胞术结果显示M3SPZ－PTEN细胞0期停滞。形态学观察和原位凋亡细胞检测可见体外培养M3SPZ－PTEN细胞及其裸鼠异种移植细胞可见凋亡形态，即细胞皱缩、胞膜膨出、染色质变集和凋亡小体形成，凋亡细胞阳性率7．5％，与对照细胞比较差异有极显著性意义（P＜0刀1）。MTT 比色法结果显示M3SPZ－PTEN对表皮生长因子（EGF）的敏感性下降，细胞存活率下降了19．6o～31．3O，与对照细胞比较差别有极显著性意义（＜0．01入PCR上LISA法检测出M3SPZ．PllW细胞端粒酶活性抑制率为20石％，差别有显著性意义u＜0．0 5）。免疫组化结果显示，M3SPZ－PTEN细胞增殖核抗原 PCNA表达减弱，表皮生长因子受体EGFR表达减弱，细胞周期蛋白抑制剂P57蛋白表达增强，细胞周期依赖激酶cdk4表达减弱，抗凋亡基因Be12蛋白表达减弱，癌基因C－mW和H1as蛋白表达减弱，抑癌基因P16和P53蛋白表达增强。 4．PlliN抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞粘附、迁移侵袭和转移特性的影响 体外粘附试验显示M3SPZ－PIEN细胞在Metrigel和Fn基质上粘附 lh 时的粘附抑制率分别为 34．3％和49．4％。体外迁移试验显示M3SPZITEN细胞在Matrigel基质上的移动抑制率为26刀％。体外侵袭实验显 第口旱巴大学悍士学位论文．4－示 M3SPZI皿 细胞侵袭抑制率为 31．4o。明胶电泳法检测结果表明M3SPZ－PTEN细胞基质金属蛋白酶WP－2和MMP－9活性降低。免疫组化染色显示M3SPZ－PTEN细胞粘附分子CD44V6表达减弱、WP－2表达减弱、转移抑制基因nln23－HI蛋白表达增强。 5．PTEN抑癌基因对高转移性粘液表皮样癌细胞药物和辐射敏感性的影响 Mh’比色法结果表明M3SPZP删细胞对抗肿瘤药物甲氨蝶吟eTX）、重组人干扰素r＊FN4入丝裂霉素归MCX多西环素（DOXy和平阳霉素（PYM的敏感性增加了1石～521 倍。MTT 比色法和平皿克隆形成试验结果表明M3SPZ－PTEN细胞对 Y－射线的敏感性也增加，放射生物学参数％减小 49．6％，辐射平均致死剂量DO减小41．7％，增敏比 SER为 1．72，DW们为 1石5。 6．D。刀联合PTEN基因转染对高转移性粘液表皮癌细胞系的影响My比色法结果表明M3SPZF 细胞对D。Xy的敏感性增加了1石5～4．75倍。流式细胞术结果显示DOXy联合PTEN基因转染组细胞＊期停滞最明显。体外粘附、迁移和侵袭试验结果表明，联合用药组细胞在vetugel或rn基质表面