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西尼罗病毒病（West Nile virus disease,WND）是由西尼罗病毒（WNV）经蚊虫叮咬感染动物和人的、以西尼罗热（WNF）和西尼罗脑炎（WNE）为主要临床症状的人兽共患传染病。自1999年在美国纽约暴发以来,每年均有动物和人感染发病。据美国动植物卫生检验局（APHIS）统计,2002年美国确诊了12 527例马匹感染,为历史最高。针对传染性疾病,疫苗是最有效的防治手段之一。当前已有4株上市的马用西尼罗病毒疫苗。其中3株是灭活疫苗,1株为含有西尼罗病毒结构基因的金丝雀痘病毒活疫苗（该活疫苗在体内不能复制）。虽然4株疫苗经免疫后均具有良好的免疫保护效果,但是马匹均需要在首免后每年加强免疫一次,才能持续获得免疫保护,疫苗成本和人力成本随之增加。因此,急需研制一种免疫1～2次即可获得持久免疫力的西尼罗病毒活疫苗。流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株（JEV SA14-14-2）属于黄病毒科黄病毒属病毒,与WNV同科同属,是建立西尼罗病毒嵌合株活疫苗的优良载体。JEV SA14-14-2安全性高,自1989年JEV SA14-14-2上市以来,经过30余年的免疫接种,该疫苗未见明显的不良反应,有效控制了流行性乙型脑炎在我国的流行。其次,流行性乙型脑炎病毒和西尼罗病毒同科同属,基因组结构相似,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗容易构建成功。WNV NY99株导致的西尼罗脑炎（WNE）致死率高,严重威胁动物和人的生命健康。虽然我国在2011年从尖音库蚊体内分离到了西尼罗病毒,但还未有动物感染发病报道,因此选用危害较大的WNV NY99株进行疫苗研究。目的:建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,以JEV SA14-14-2为载体,构建含有西尼罗病毒pr MΔE基因的嵌合株病毒ChiVax-WN01,并验证其免疫原性,为研制经济高效的马用西尼罗病毒候选疫苗奠定基础。方法:（1）JEV SA14-14-2全基因组序列测定。本研究采用蚀斑纯化法,利用BHK-21细胞经3轮纯化获得JEV SA14-14-2蚀斑单克隆,并利用BHK-21细胞扩繁病毒。提取病毒RNA并反转录成c DNA,通过PCR方法分11段扩增病毒全长c DNA,分别连入p EASY-Blunt克隆载体测序。利用DNAStar和DNAMAN比对并拼接病毒全长基因组序列,获得JEV SA14-14-2全基因组c DNA序列。（2）建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统。利用DNAStar软件分析JEV SA14-14-2序列,选取4个单克隆酶切位点将病毒基因组全长分为5段（F1～F5）。利用分子生物学技术引入T7 promoter序列、HDVr序列、T7 terminator序列和内含子序列,分段连接5个片段,构建含有病毒全长c DNA的感染性克隆质粒p FLJEV。通过Lipofectamine 3000将p FLJEV转染BSR T7/5细胞拯救病毒。通过蚀斑形态、生长曲线和病毒核酸复制能力鉴定并比较拯救毒和母本毒的生物学特性。（3）西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01构建与鉴定。基于JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,将WNV NY99株（DQ211652）的prMΔE基因替换JEV SA14-14-2的pr MΔE基因,构建含有WNV NY99 pr MΔE基因的嵌合株感染性克隆质粒p ChiVax-WN01。利用Lipofectamine 3000将p ChiVax-WN01转染BSR T7/5细胞拯救病毒。鉴定并比较嵌合株病毒ChiVax-WN01的生物学特性。（4）西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01安全性与实验免疫研究。以BALB/c小鼠为动物模型,经腹腔分别注射105～101 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和JEV SA14-14-2母本毒,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠神经侵袭性。分别经颅内注射100 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和100 PFU JEV SA14-14-2,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠的神经毒性。为验证ChiVax-WN01免疫原性,以BALB/c小鼠为动物模型,分别腹腔接种100 PFU JEV SA14-14-2、100 PFU ChiVax-WN01和PBS,接种后1 d、3 d、5 d、7 d和9d分别取各组小鼠的血浆、脑、肝、脾、肺和肾,利用蚀斑法检测病毒在血液的增殖水平和内脏的分布。通过微量中和试验测定小鼠血清的中和抗体效价。通过ELISpot法测定脾淋巴细胞中分泌IFN-γ、IL-2和IL-4细胞的数量。结果:（1）获得JEV SA14-14-2全长序列,Gen Bank序列号为MK585066。（2）成功构建出JEV SA14-14-2感染性克隆质粒pFLJEV,转染拯救出在病毒滴度、生长动力学特征和蚀斑形态方面与母本病毒无明显差别的子代病毒,经电镜超薄切片可观察到完整病毒粒子。（3）成功构建出嵌合株病毒感染性克隆质粒p ChiVax-WN01,成功拯救出子代病毒ChiVax-WN01,电镜观察可见包装完整的病毒粒子。（4）神经侵袭性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率均为100%,与JEV SA14-14-2组和PBS组无差别。神经毒性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率为50%,有神经毒性,JEV SA14-14-2组和PBS组小鼠存活率100%。病毒在内脏分布情况表明,ChiVax-WN01接种后各个时间点内脏中均未检测到病毒滴度。嵌合株病毒ChiVax-WN01能诱导机体产生中和抗体,效价为1:90,并可显著提高IFN-γ和IL-2分泌细胞在脾淋巴细胞中的比例。以上结果表明,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01腹腔接种具有较高的安全性和良好的免疫原性。结论:成功建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,并基于该系统构建构建了ChiVax-WN01,且ChiVax-WN01在小鼠上具有较好的安全性和免疫原性。