第一部分硼替佐米对激素抵抗或复发ITP患者体内长寿命浆细胞的作用探究研究目的:探究激素抵抗或复发的原发性免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患者骨髓内长寿命浆细胞的情况,并通过硼替佐米的蛋白酶体抑制作用来探究抗血小板特异性IgG分泌长寿命浆细胞在ITP发病机制中的作用。研究方法:1.取ITP患者与健康志愿者的骨髓组织切片进行免疫组化分析,检测两组CD138+浆细胞在骨髓有核细胞中的百分比是否存在统计学差异。2.取ITP患者与健康志愿者的骨髓液,裂解红细胞后用流式细胞学分析检测骨髓有核细胞中CD38hiCD138+浆细胞的百分比在组间是否存在统计学差异,同时检测两组间CD19-CD38hiCD138+的总长寿命浆细胞的平均百分比有无显著统计学差异。3.取ITP患者与健康志愿者的骨髓组织制作冰冻切片,并在完成CD19和CD138染色后进行免疫荧光共聚焦检测,观察CD19和CD138的共表达情况,并统计CD138+细胞中CD19的阴性率,以及CD19-CD138+的长寿命浆细胞占有核细胞的百分比。4.考虑到硼替佐米对蛋白酶体的抑制特性,我们研究了硼替佐米是否可以减少骨髓中长寿命浆细胞的数量,并进一步限制抗血小板自身抗体的分泌。ITP骨髓液分选所得骨髓单个核细胞在加或不加0.25 ng/mL硼替佐米的情况下培养5天后,用流式细胞学分析检测CD19-CD38hiCD138+长寿命浆细胞的百分比,并同时检测CD3+T细胞、CD20+B细胞和CD56+NK细胞的百分比有无变化。5.为检测硼替佐米对分泌抗GPⅡb/Ⅲa特异性自身抗体的长寿命浆细胞数目的影响,我们用磁珠分选所得的CD19-CD138+长寿命浆细胞进行了 GPⅡb/Ⅲa特异性ELISpot检测。给药组加入25 ng/mL的硼替佐米,对照组加等量生理盐水,培养20 h。6.为了明确硼替佐米对抗血小板抗体分泌的影响,我们用加或不加0.25 ng/mL硼替佐米培养5天的CD19-CD138+长寿命浆细胞上清液,进行了改良MAIPA分析。7.基于硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂的作用机制,我们进一步通过Annexin V染色探究了硼替佐米是否能诱导长寿命浆细胞凋亡。同时,用CD138-PE/Cy7和CD19-APC标记长寿命浆细胞。将培养的BMMCs分为4组,分别用4个浓度梯度的硼替佐米(0、0.25、25和2500 ng/mL)进行处理。处理6 h后,用流式细胞仪测定Annexin V阳性凋亡细胞的比例。8.为了确定硼替佐米减少长寿命浆细胞的数量的机制,是通过蛋白酶体抑制作用而不是通过非特异性作用(例如细胞毒性),我们接下来用蛋白酶体活性检测试剂盒对硼替佐米组和对照组间蛋白酶体活性进行了检测分析。9.为了探究硼替佐米是否能在活体内减轻ITP,我们建立了主动型ITP小鼠模型来评价其作用。CD61敲除小鼠用CD61+的野生型血小板免疫,取其免疫后脾细胞注入已接受全身照射的SCID小鼠体内。将模型小鼠分为两组:硼替佐米处理组,从第3周起始至第4周末,以每周两次的频率给予尾静脉注射20 μg/kg的硼替佐米;而不给药对照组给予尾静脉注射等量生理盐水。在照射后的第19天至第28天,所有小鼠通过饮用水摄取BrdU(0.8 mg/mL)。连续4周每周记录小鼠外周血的血小板计数。10.在第4周结束后处死所有小鼠,采集小鼠的骨髓进行流式细胞学分析。BrdU-CD138+浆细胞即为长寿命浆细胞。同时检测CD3+T细胞或CD20+B细胞的改变。研究结果:1.骨髓组织切片免疫组化的结果显示,ITP患者骨髓中CD138+浆细胞的平均百分比明显高于健康对照组。与此结果一致的是,流式细胞学分析显示ITP患者骨髓中CD38hiCD138+浆细胞的百分比显著高于健康志愿者。然而,两组间CD19-CD38hiCD138+的总长寿命浆细胞的平均百分比无显著统计学差异。2.骨髓组织冰冻切片的共聚焦免疫荧光显微镜检测显示,ITP患者CD138+细胞中CD19阴性率为30.96±16.07%,与健康对照组的情况(42.06±23.08%)无显著性差异。此外,统计所得CD19-CD138+长寿命浆细胞在有核细胞中的比例在ITP患者和健康志愿者之间没有显著统计学差异。3.ITP的骨髓单个核细胞在加或不加0.25 ng/mL硼替佐米的情况下体外培养5天后,经流式细胞学分析显示,硼替佐米组骨髓单个核细胞中CD19-CD38hiCD138+长寿命浆细胞的百分比为0.02±0.01%,显著低于未给药对照组(0.04±0.02%)。硼替佐米对CD3+T细胞、CD20+B细胞和CD56+NK细胞的比例没有显著影响,提示硼替佐米对浆细胞的抑制作用具有特异性。4.用磁珠分选所得的CD19-CD138+长寿命浆细胞进行的GPⅡb/Ⅲa特异性ELISpot检测结果显示,在激素抵抗或复发ITP患者的CD19-CD138+长寿命浆细胞中观察到了一定数量的抗GPⅡb/Ⅲa IgG分泌细胞,而在健康志愿者中几乎没有观察到。在培养20 h后的ELISpot板中,硼替佐米处理组出现的斑点数明显少于未加硼替佐米的对照组,此结果直观地证明了硼替佐米对长寿命浆细胞清除的显著作用。5.改良MAIPA分析显示,与之前GPⅡb/Ⅲa特异性长寿命浆细胞的变化一致,硼替佐米处理组上清液的吸光度明显低于未处理对照组,提示硼替佐米处理组抗GPⅡb/Ⅲa抗体浓度明显降低。6.硼替佐米诱导凋亡的检测结果表明,随着硼替佐米浓度的增加,4个浓度梯度组Annexin V阳性凋亡细胞的百分率亦随之增加,表明硼替佐米对长寿命浆细胞的凋亡作用呈浓度依赖性。相比之下,不同组间B细胞、T细胞和NK细胞的凋亡比例保持稳定,未显示统计学差异。7.蛋白酶体活性检测分析结果显示,硼替佐米组的相对荧光单位较对照组明显降低,这提示硼替佐米对长寿命浆细胞中蛋白酶体的活性有一定的抑制作用。8.主动型ITP小鼠模型实验结果显示,硼替佐米处理组小鼠在照射后第4周末血小板水平显著高于未给药对照组小鼠,且血小板计数随着时间的推移上升更快。9.模型小鼠骨髓流式细胞学分析显示,硼替佐米组浆细胞百分比为0.15±0.06%,明显低于未给药对照组(1.00±0.30%),此结果提示硼替佐米对浆细胞有显著影响。未观察到CD3+T细胞或CD20+B细胞的改变。硼替佐米组BrdU-CD138+长寿命浆细胞的比例为0.06±0.05%,较未给药对照组明显降低(0.69 ±0.11%)。研究结论:1.在糖皮质激素抵抗或复发的ITP患者的骨髓中存在持续分泌抗血小板抗体的血小板特异性长寿命浆细胞。2.硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂可减少抗血小板抗体产生长寿命浆细胞的数目。3.硼替佐米可降低培养上清液中分泌的抗血小板自身抗体的浓度。4.在主动型ITP小鼠模型中,应用硼替佐米能有效减轻血小板减少症的严重程度。5.本研究为ITP的发病机制研究提供了补充,为ITP的临床治疗提供了新的可行的靶点和药物选择。第二部分血小板内NLRP3炎症复合体的活化参与ITP的机制研究研究目的:探究ITP血小板内抗氧化能力及细胞内氧化应激的改变,探讨NLRP3炎症复合体在ITP血小板中的活化情况,完善ITP的发病机制和病理生理学的研究。研究方法:1.为探究ITP患者血小板中NLRP3的表达是否增高,取ITP患者和健康志愿者的血小板,用CD61和NLRP3流式抗体染色后,检测CD61+血小板内NLRP3的表达情况。2.取ITP患者和健康志愿者的血小板,裂解后提取总蛋白,用免疫印迹实验进一步验证NLRP3炎症复合体在蛋白水平的表达情况,实验过程检测了NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 和 cleaved IL-1β 的水平。3.之后又从转录表达情况进一步验证,取ITP患者和健康志愿者的血小板,提取mRNA后反转录为cDNA,进行实时荧光定量PCR检测,测定NLRP3、ASC、caspase-1 和 IL-1β 的 mRNA 表达情况。4.为进一步评估NLRP3炎症复合体的活化情况,我们又用免疫荧光检测观察了 ITP患者和健康志愿者的血小板中NLRP3和ASC的共定位情况,二者共定位提示NLRP3炎症复合体发生了装配和活化。5.此外,我们还用caspase-1活性检测试剂盒分析了 ITP和健康血小板内caspase-1的活性,进一步验证NLRP3炎症复合体的活化。6.为明确NLRP3炎症复合体活化的原因,我们首先用ROS检测试剂盒检测了 ITP血小板内的ROS水平;并且用DCFH-DA通过流式细胞学分析检测了H202处理30 min条件下血小板内的抗氧化能力。7.接下来,我们用免疫印迹法检测了 ITP和健康血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性,即H202处理前后NLRP3、ASC、cleavedcaspase-1和cleaved IL-1 β相对表达量的改变情况。8.我们用还原剂NAC进一步明确了降低的抗氧化能力在ITP血小板NLRP3炎症复合体活化中的作用。血小板在H202处理前先用NAC预处理1h,在H2O2孵育 30min 后,用免疫印迹法检测 NLRP、ASC、cleavedcaspase-1 和 cleaved IL-1β表达的改变;此外,用caspase-1活性试剂盒检测caspase-1活性的改变。9.接下来,我们用NLRP3抑制剂MCC950和caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK评估了 NLRP3炎症复合体活化对ITP血小板焦亡的诱导情况。在ITP血小板暴露于H2O2前,先用MCC950和Z-YVAD-FMK预处理30 min,然后用流式分析检测annexin-V+/caspase-l+的焦亡细胞百分比。并用ELISA检测培养上清中分泌的IL-1β的浓度变化。研究结果:1.ITP患者和健康志愿者的血小板流式分析结果显示,ITP血小板中的NLRP3平均荧光强度显著高于健康血小板,提示ITP血小板中NLRP3的表达增加。2.血小板免疫印迹实验结果显示,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β的水平在ITP血小板中均显著升高,进一步验证了 NLRP3炎症复合体在蛋白水平的表达增强。3.血小板mRNA实时荧光定量PCR结果与蛋白表达水平的变化一致,即ITP血小板中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平较健康志愿者显著升高,提示了 NLRP3炎症复合体的转录增强。4.血小板免疫荧光结果显示,NLRP3和ASC在ITP血小板内发生了共定位,而在健康志愿者的血小板内无显著共定位,提示ITP血小板内有增强的NLRP3炎症复合体的装配和活化。5.血小板内caspase-1检测结果显示,ITP患者血小板内caspase-1的活性较健康对照组显著增强,结合之前免疫印迹结果显示的cleaved IL-1β蛋白水平增加,提示ITP血小板中NLRP3炎症复合体发生了活化。6.ROS试剂盒检测得ITP血小板与健康对照血小板内ROS水平无显著统计学差异;而血小板内抗氧化能力检测显示,ITP血小板内的抗氧化能力较健康血小板显著下降。7.免疫印迹法检测H202处理后血小板内NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和cleaved IL-1β相对表达量增加,且ITP的倍增数显著高于健康志愿者,提示ITP血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性高于健康志愿者。8.用还原剂NAC预处理的ITP血小板,在H2O2处理后,免疫印迹法显示其 NLRP、ASC、cleaved caspase-1 和 cleaved IL-1β 的表达较未用 NAC 的对照组显著下降。且与此一致的是,NAC预处理的ITP血小板,在H202处理后,其caspase-1活性亦较未用NAC的对照组显著下降。9.用 NLRP3 抑制剂 MCC950 和 caspase-1 抑制剂 Z-YVAD-FMK 预处理 ITP血小板,再暴露于H2O2后,流式分析检测annexin-V+/caspase-1+的焦亡细胞百分比显著低于未预处理对照组。此外,ELISA结果显示,用MCC950和Z-YVAD-FMK预处理的ITP血小板培养上清中分泌的IL-1β的浓度亦较未处理对照组下降。研究结论:1.ITP患者血小板中NLRP3炎症复合体的蛋白和mRNA水平的表达较健康血小板均增加。2.ITP血小板内NLRP3炎症复合体的装配和活化较健康血小板增强。3.ITP血小板内的抗氧化能力较健康血小板显著下降。4.ITP血小板内NLRP3炎症复合体活化对ROS反应的敏感性高于健康志愿者血小板。5.ITP血小板内降低的抗氧化能力导致细胞内氧化应激增强,从而诱导NLRP3炎症复合体活化。6.NLRP3炎症复合体活化诱导了 ITP血小板的焦亡增加,并增加IL-1β的分泌,导致下游炎症状态的增强。第三部分I TP中IL-36细胞因子的表达谱变化及其参与ITP作用的初步探索研究目的:探究 ITP 中 IL-36 细胞因子(IL-36α、IL-36β、IL-36y 和 IL-36Ra)的表达谱,初步探究IL-36细胞因子与ITP的相关关系,进一步完善ITP的机制或病理生理学研究。研究方法:1.招募了 25个活动期ITP患者和13个缓解期ITP患者,此外,另有20个年龄性别匹配的健康志愿者作为正常对照。2.采集外周血,制取乏血小板血浆,用人IL-1家族细胞因子阵列检测试剂盒检测 IL-36β、IL-36y、IL-36Ra 和 IL-38 的血浆水平,用 Human IL-36alpha/IL-1F6 DuoSet ELISA试剂盒检测IL-36α的血浆水平。3.从外周血中分选单个核细胞,提取RNA并反转录为cDNA,行实时荧光定量PCR,检测IL-36细胞因子的转录水平。4.接下来,我们采用相关性分析检验,探讨分析了在活动期ITP患者中,IL-36细胞因子与ITP特征性的血小板计数之间的相关性。5.考虑到抗血小板抗体亦为ITP特征性表现,我们又分析了 IL-36细胞因子与抗血小板抗体之间的关系,将进行过抗体检测的17名活动期ITP患者分为抗体阳性和抗体阴性两组进行比较分析。6.此外,我们还分析了活动期ITP患者PBMCs中IL-36的mRNA水平与IL-36R的相关性,以及血浆中IL-36与IL-17、IFN-γ的相关性。7.考虑到IL-36细胞因子分为激动性和拮抗性,我们又分析了 IL-36激动剂/抑制剂(agonists/antagonists)比值与血小板计数和抗血小板自身抗体的关系。IL-36 agonists/antagonists比值的计算公式如下:(IL-36α倍增数+IL-36β倍增数+IL-36γ倍增数)/(IL-36Ra倍增数+IL-38倍增数)。研究结果:1.与健康对照相和缓解期ITP相比,活动期ITP患者血浆中的IL-36α的水平显著下降,且与健康对照相比IL-36γ的水平在ITP患者中亦显著减低。而缓解期ITP与健康对照间均无统计学差异。此外,IL-36β、IL-36Ra和IL-38的血浆水平在三组之间均无差异。2.实时荧光定量PCR检测结果显示,IL-36αmRNA的改变与血浆水平变化一致,活动期ITP患者PBMCs中mRNA水平与健康对照相比亦显著下降。IL-36γ、IL-36Ra和IL-38的mRNA水平在三组之间无统计学差异。IL-36β的mRNA水平过低、无法检测。3.活动期ITP患者IL-36细胞因子与血小板计数相关性分析显示,IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra和IL-38与血小板计数均无显著相关性。4.抗血小板抗体阳性和阴性两组的活动期ITP患者血浆中IL-36α、IL-36β、IL-36y、IL-36Ra和IL-38水平均无显著统计学差异,排除了 IL-36与抗血小板抗体之间的关系。5.活动期ITP患者PBMCs中IL-36的mRNA水平与IL-36R的相关性无显著统计学意义,此外,血浆中IL-36与IL-17、IFN-γ的相关性亦未见统计学意义。6.IL-36 agonists/antagonists比值与血小板计数、抗血小板自身抗体均未发现显著统计学相关关系。研究结论:1.活动期ITP患者的血浆中IL-36α和IL-36γ水平较健康正常人降低。2.活动期ITP患者外周血单个核细胞中IL-36α的mRNA水平较健康正常人降低。3.IL-36细胞因子与血小板计数、抗血小板抗体的有无、IL-36R、IL-17和IFN-γ均未发现显著相关性。4.IL-36细胞因子在ITP中的变化明确,但其参与ITP的具体机制仍需未来进一步的筛查与探索。