人体内脂质无法正常代谢是动脉病变的要素,粥样硬化斑产生后阻碍人体循环,则心脑血管疾病随之而来。高脂血症就是体内脂质无法正常代谢的一种代谢病,表现出的特征是血清中某些特定指标的升高或者降低。目前,临床上某些用于治疗高脂血症的药物虽然疗效显著但往往伴随着许多不良反应,这些药主要是他汀、烟酸和贝特类等,除恶心头晕胃肠刺激这种轻微症状外它们带来的严重副作用还有肝损伤和肌病的出现。天然药物多糖广泛存在于自然界的动植物甚至微生物中,越来越多的研究中表现多糖具有优良的生物活性且具有天然无毒的优势。葛根(Pueraria lobata(willd.)ohwi)是一种可以做葛粉食用也有丰富药用价值的植物,其黄酮类成分显著的生物活性为大家熟知和广泛应用,而它另外的一种主要成分葛根多糖也同样具有良好的药理作用。本论文从传统葛根药材中提取葛根多糖并对其进行结构鉴定以及活性评价,并尝试分析葛根多糖结构鉴定的结果和其活性评价的结果究竟有何种关联,然后选择脂质体这种新剂型进行制剂优化,研究内容包括质量及活性评价。第一章综述本章主要对天然葛根多糖近年来的研究进展进行了综述,着重介绍了多糖的分离纯化,结构解析以及制剂研究的各种方法。总结阐述了葛根多糖的生物活性,理化性质特征等,同时围绕多糖新剂型的发展和特点作简要的梳理,为论文后续的讨论与研究奠定理论基础。第二章葛根多糖的分离纯化及其理化性质研究本章用水提醇沉的方法从藤本植物野葛的根中获得了葛根粗多糖,除去蛋白等杂质后的多糖得率为5.68%。葛根粗多糖经大孔吸附树脂D101和DEAE-52纤维素柱分离及纯化,得到两种纯化多糖组分PLR1和PLR2。第一个是大孔吸附树脂D101的10%醇洗脱组分将其命名为PLR1,第二个是纤维素的水洗脱组分命名为PLR2。分别对PLR1和PLR2进行了理化性质的检验,结果表明PLR1中含有97.32±1.18%的多糖,3.53±0.54%的蛋白质和1.22±0.39%的糖醛酸。PLR2中含有95.79±1.68%的多糖,0.22±0.08%的糖醛酸和1.46±0.37%的蛋白质。二者的紫外全波长扫描在特定波段无明显吸收峰,显示只含有极少量的蛋白和核酸等杂质。使用HPLC-ELSD测定分子量大小,图谱显示PLR1和PLR2均为分子量集中的单一对称峰,分子量分别为19.7 kDa和2.3 kDa。第三章葛根多糖PLR1和PLR2的结构特征研究本章对纯化所得葛根多糖PLR1和PLR2进行初步的结构研究,研究的内容包括组成成分、键型分析、空间构象等,除了使用高碘酸氧化试验、刚果红试验等化学方法,还利用了核磁共振NMR、扫描电镜、原子力显微镜等仪器分析方法。PLR1和PLR2水解后经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)处理衍生化,利用高效液相色谱法测定单糖成分结果显示,PLR1由葡萄糖和鼠李糖构成,其摩尔比为93.65:6.34,而PLR2则是一种单一的葡聚糖。高碘酸氧化实验结果表明PLR1主要由1→3和1→6糖苷键组成,其比例为44.99%和39.75%,而PLR2主要由1→2或1→4糖苷键构成,比例高达67.41%。刚果红结果分析显示,二者都不具有三螺旋结构。综合PLR1和PLR2的红外光谱和核磁图谱分析显示二者糖苷键构型都为α构型,且都不存在糖醛酸吸收峰。这表示PLR1和PLR2都为中性多糖,与糖醛酸含量测定结果相符合。扫描电镜SEM观察表明,PLR1表面呈现出不规则的触角状结构且周围点缀大小不一的圆形结构,形状散乱且出现部分堆叠,这可能是因为PLR1分子量较大分子间吸引力强,这可能导致其结构复杂且无定型。而PLR2分子量较小易形成不规则的几何外形,所以呈碎屑状聚集,表面部分光滑少量褶皱呈乳滴状结构中间出现孔隙。原子粒显微镜AFM检测表明,PLR1为复杂链状结构且具有很多支链,链的高度范围从1.2 nm到6.1 nm,这表明发生了分子聚集。PLR2二维图像显示点随意排列分布点与点之间距离不紧密即链与链之间不缔结,其三维图像结构的高度超过单个多糖分子的高度说明存在分子间的相互聚集但是其强度不如PLR1。第四章葛根多糖的降血脂活性研究本章诱导小鼠引发高脂血症是通过长期喂食固定量的高脂配方粮食来实现的,在此模型中评价葛根多糖PLR1和PLR2治疗缓解高脂血症的生理活性。用试剂盒检测所得小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平结果发现,持续给药30天后葛根多糖PLR1和PLR2(100、200、300 mg/kg/d)与模型组相比能显著降低血清TC、TG、LDL-C水平且提高血清HDL-C水平(P<0.05或P<0.01)。小鼠肝脏组织的病理学检测结果表明,经PLR1和PLR2口服给药治疗后,高血脂模型小鼠的肝细胞受损情况明细好转细胞形态相对整齐,未见脂肪粒空泡样病变,肝细胞炎症损伤也有所缓解,这些现象说明葛根多糖能在一定程度上改善高脂血症小鼠的肝病变情况。本章还探讨了葛根多糖的降血脂作用可能归因于它们的糖苷键构型及分支链结构。第五章制备葛根多糖PLR1脂质体并评价降血脂活性本章制备葛根多糖PLR1的脂质体采用了逆相蒸发法,单因素试验考察了四种因素对包封率和载药量的影响,排除旋蒸的温度这一影响较小的因素后利用Box-Behnken模型进行响应面设计得到PLR1葛根多糖脂质体的最佳处方,并对按照最佳处方工艺制备出的葛根多糖脂质体进行评价。理化性质评价内容包括包封率、平均粒径、表观形态和稳定性等多种指标。活性评价的具体方法是利用泊洛沙姆P-407诱导小鼠急性高血脂模型,给小鼠口服相同剂量的PLR1葛根多糖和PLR1葛根多糖脂质体,以此考察了PLR1脂质体的降血脂药效。实验结果表明,在60℃的条件下,大豆卵磷脂与多糖、胆固醇、吐温80质量比分别是24.32:1、7.07:1和9.68:1,按此处方制备的脂质体包封率达到77.29±1.12%。PLR1葛根多糖脂质体在透射电镜下呈囊球状,平均粒径大小为117.32±5.36 nm,粒径范围较窄呈正态分布,粒径大小均匀。Zeta电位分析结果显示其值为-19.37±0.74 m,绝对较值大,表明其可能具有较好的稳定性。初步稳定性试验结果证实了这一点,在室温条件下放置一个月,脂质体没有肉眼可见的沉淀发生。包封率稍有降低但不具有显著性,且粒径值浮动不大说明制备的葛根多糖脂质体稳定性良好。通过P-407诱导小鼠急性高脂血症模型,对比相同剂量的葛根多糖原料药组,观察葛根多糖脂质体PLR1L的降血脂药效。实验结果表明,PLR1脂质体组在TC、TG、LDL-C等指标上表现出比PLR1原料药组更好的降血脂活性。但是,PLR1原料药组和PLR1脂质体组均对血清HDL-C没有显著的升高作用,也就是说对于P-407诱导的高脂血症小鼠,葛根多糖不适合用于治疗其HDL-C过低的症状。脂质体有助于葛根多糖在体内的降血脂药效,这为葛根多糖制剂的研究拓宽新的思路。