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肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,C.pneumoniae,C.pn)是一种专性胞内寄生的衣原体属微生物,能够感染人和马、考拉等多种家养及野生动物,是一种重要的人畜共患病原体。C.pn急性感染会导致咽炎、鼻窦炎、支气管炎、肺炎等一系列呼吸系统疾病,慢性持续感染则与肺癌、哮喘、阿尔兹海默病和冠心病等重要心血管疾病的致病原因密切相关。由于缺乏特征性临床症状,因此需要在实验室进一步进行鉴定。目前临床检测手段主要包括分离培养法、酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、微量免疫荧光试验(Micro-immunofluorescence,MIF)、PCR分子检测技术等。但分离培养法耗时长,对早期诊断意义不大。Cpn感染中特异性IgG、IgM上升缓慢,血清学检测会贻误检测时间。PCR方法操作复杂,对检测环境要求较高,易产生假阳性,导致难以商业化,一般用于实验研究。目前缺乏一种对环境要求低,高灵敏、易操作的C.pn检测技术。纳米材料应用于生物传感器的设计已经在生命科学等多个领域受到了广泛研究,利用纳米材料独特的光学性质、磁性质和催化性质,成功建立了多种针对小分子和微生物的检测方法。本研究设计了一种纳米探针结合暗场显微镜直接肉眼计数的简易策略,来方便快速地检测样本中的C.pn。简单来说,就是构建了一种金纳米探针(Gold nanoparticles probe,GNP probe):粒径15nm的金纳米粒子表面修饰C.pn抗体,制备成为可以靶向结合C.pn的特异性探针。金纳米探针捕获样品中的C.pn,利用金纳米粒子的强散射特性,在40倍物镜10倍目镜下暗场视野中观察,可见清晰易辨的明亮金黄色“花环状”结构。本研究的金纳米探针-暗场显微计数法检测经细胞扩增的C.pn样品,检测限可低至单个C.pn细胞/微升。在检测体系构建过程中,通过SDS-PAGE电泳、透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)及实时荧光定量PCR技术,验证金纳米探针-暗场显微计数法检测结果的一致性和可靠性。所有数据结果表明:该检测体系用于检测肺炎衣原体,操作简单、检测快速(约半小时)并且极其灵敏(能实现单细胞检测)。接着我们也用此方法检测了模拟的真实样本。采用C.pn接种C57BL/6J小鼠,采集其肺脏组织分离C.pn,制备真实样品,使用金纳米探针-暗场显微计数法进行组织样本中C.pn的浓度测定,同时采用荧光定量PCR及数字PCR检测方法对比检测。结果表明:组织样品处理后,采用金纳米探针-暗场显微计数法约半小时得到的检测数据与两种PCR方法相符合。证明本研究构建的金纳米探针-暗场显微计数法可用于实际检测,未来可以用于临床上绝对定量检测C.pn,有望将该方法推广到其他病原体检测。总结而言,本研究构建一种由protein A修饰的金纳米颗粒与C.pn抗体耦联而得到的金纳米探针,能够有效地捕获C.pn,在透射电子显微镜形成数百个金纳米探针吸附于一个C.pn细胞表面的“芝麻饼”样的图案。此结构在普通光学显微镜的暗场下呈现明亮的“花环状”结构,可用肉眼直接计数。本研究构建的金纳米探针-暗场显微计数策略,制备探针简单、检测样本快速、超灵敏(灵敏度达到单个C.pn细胞/微升)。非常适合基层单位现场快速定性鉴定养殖动物样本中是否感染C.pn以及精确定量样本中C.pn的浓度。