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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）作为最常见的神经退行性疾病,其神经病理特征主要包括由β淀粉样蛋白（Amyloidβ,Aβ）沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化所致的神经原纤维缠结。Aβ可促进小胶质细胞的炎症反应,导致白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎症细胞因子的释放。研究表明,葡萄糖代谢与小胶质细胞活化介导的炎症反应密切相关,氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation,OXPHOS）到有氧糖酵解的代谢转变已经成为小胶质细胞炎症激活的标志。然而有氧糖酵解是否参与调控Aβ介导的小胶质细胞炎症,以及通过何种机制发挥作用尚不完全清楚。本课题将以小鼠小胶质细胞系BV2细胞和6月龄雄性C57BL/6N小鼠为细胞和动物研究模型,探讨Aβ1-42处理后炎症细胞因子表达和有氧糖酵解水平的变化;通过转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）技术检测并分析抑制有氧糖酵解后Aβ1-42对小胶质细胞基因表达谱变化的的影响;研究有氧糖酵解参与Aβ1-42介导的小胶质细胞炎症反应中的作用机制。第一部分Aβ1-42促进小胶质细胞增殖和炎症的量效实验目的:以小鼠小胶质细胞系BV2细胞为研究对象,研究不同浓度Aβ1-42对BV2细胞增殖、活化和炎症因子表达水平的影响。方法:通过MTS细胞增殖检测方法观察不同浓度Aβ1-42刺激12 h对小胶质细胞增殖的影响;通过显微镜观察并分析Aβ1-42刺激BV2细胞12 h后其数目和形态的变化;通过RT-PCR和Western blot实验方法检测不同浓度Aβ1-42刺激BV2细胞12 h后,细胞炎症因子IL-1β和TNF-αm RNA水平的变化。结果:MTS细胞增殖检测结果显示Aβ1-42对小胶质细胞增殖的影响存在量效性,2.5μM和5μM Aβ1-42刺激12 h时对BV2细胞活力的影响最为显著;显微镜下我们观察到Aβ1-42刺激BV2细胞12 h后细胞数量显著高于Con组,且其形态由分支状变为阿米巴状,并伴有胞体增大;RT-PCR实验结果显示,相对于Con组,2.5μM组、5μM组和10μM组的IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白的表达均显著升高,且5μM组表达水平则更为显著。因此在后续的实验中,我们选取Aβ1-42的作用浓度为5μM。结论:1.低浓度（5μM）Aβ1-42对BV2细胞的促增殖最显著。2.低浓度（5μM）Aβ1-42诱导BV2细胞形态由分支状变为阿米巴状,并伴有胞体增大。3.给予BV2细胞5μM Aβ1-42刺激12 h后,炎症因子IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白的表达明显升高。第二部分有氧糖酵解调控Aβ1-42诱导小胶质细胞炎症反应目的:以小鼠小胶质细胞系BV2细胞和SPF级健康6月龄C57BL/6N小鼠作为研究对象,检测Aβ1-42刺激小胶质细胞炎症的发生是否伴随有氧糖酵解过程,随后给予2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxyglucose,2-DG）或己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）-sh RNA抑制小胶质细胞有氧糖酵解过程后,检测炎症因子表达水平的变化。方法:通过乳酸试剂盒检测Aβ1-42对BV2细胞中乳酸含量的影响,并给予2-DG预处理检测Aβ1-42对BV2细胞中乳酸含量的影响;通过RT-PCR方法检测2-DG预处理后Aβ1-42对BV2细胞中IL-1β和TNF-αm RNA表达的影响;小鼠海马区脑立体定位注射Aβ1-42,并通过免疫荧光染色实验分析C57BL/6N小鼠海马中小胶质细胞的激活情况;通过RT-PCR方法检测2-DG预处理后Aβ1-42对C57BL/6N小鼠海马内IL-1β和TNF-αm RNA水平的影响;通过sh RNA慢病毒感染的方法敲低BV2细胞中HK2,并通过RT-PCR和Western blot实验方法检测敲低效率;通过RT-PCR和Western blot实验方法检测HK2-sh RNA预处理后,Aβ1-42对BV2细胞炎症因子IL-1β和TNF-αm RNA和蛋白水平的影响。结果:乳酸试剂盒检测结果显示Aβ1-42可增加BV2细胞中乳酸含量,但给予2-DG后该作用被抑制;RT-PCR结果显示,2-DG预处理后可显著抑制Aβ1-42对BV2细胞中IL-1β和TNF-αm RNA的表达的促进作用;免疫荧光染色实验结果显示,2-DG预处理后可显著抑制Aβ1-42对C57BL/6N小鼠海马区小胶质细胞的激活;RT-PCR方法结果显示2-DG预处理后可显著抑制Aβ1-42对C57BL/6N小鼠海马区IL-1β和TNF-αm RNA表达的促进作用;RT-PCR和Western blot实验方法结果显示90956组HK2-sh RNA慢病毒可显著敲低HK2 m RNA和蛋白;RT-PCR和Western blot实验结果显示HK2-sh RNA预处理后可显著抑制Aβ1-42对BV2细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白表达的促进作用。结论:1.Aβ1-42可增强BV2细胞中的有氧糖酵解过程。2.给予2-DG或HK2-sh RNA抑制有氧糖酵解过程后,可显著下调Aβ1-42对炎症因子IL-1β和TNF-α表达的促进作用。3.给予2-DG抑制C57BL/6N小鼠海马区有氧糖酵解过程后,可显著下调Aβ1-42对小胶质细胞的激活作用。第三部分敲低HK2后Aβ1-42刺激BV2细胞的转录组测序分析目的:为进一步研究Aβ1-42诱导小胶质细胞有氧糖酵解过程对其免疫炎症反应的作用机制,以小鼠小胶质细胞系BV2细胞为研究对象,对经HK2-sh RNA和nc-sh RNA预处理的BV2细胞予以Aβ1-42诱导后进行RNA-seq,筛选相关的差异表达基因,并选取部分差异基因进行验证,探讨有氧糖酵解在Aβ1-42诱导BV2细胞炎症反应中的调控作用。方法:HK2-sh RNA和nc-sh RNA预处理BV2细胞,并给予Aβ1-42刺激12 h,提取m RNA进行转录组测序及生物信息学分析和验证;通过构建文库后以高通量测序技术得到全转录组的基因序列,对测序数据进行质量评估;通过差异分析软件获得差异基因表达结果,绘制m RNA聚类分析热图和火山图,同时对差异的基因进行GO功能富集分析和KEGG富集分析;通过RT-PCR实验对部分差异基因进行验证。结果:测序质量结果显示所有样本Q30均可达到90%以上,可用于后续研究,基因表达水平高且FPKM值在各组之间的总体分布一致;聚类分析结果分析显示与对照组相比,在HK2-sh RNA预处理后的样本中鉴定了543个差异表达的基因,其中上调的有346（63.72%）个,下调的有197（36.28%）个。KEGG富集分析富集到的信号通路有322条,其中上调的有214条,下调的有108条;选择与炎症相关的差异基因趋化因子CXC配体2（Chemokine ligand 2,Cxcl2）、双特异性磷酸酶10（Dual specificity phosphatase 10,Dusp10）、促红细胞生成素产生肝细胞受体A2（Erythropoietin—producing hepatocellular receptor A2,Eph A2）和基质金属蛋白酶9（Matrix metallopeptidase 9,Mmp9）进行验证,RT-PCR结果显示Cxcl2和Eph A2 m RNA的表达显著下调,与测序结果一致。结论:1.GO分析显示共346个差异基因表达显著上调,197个差异基因表达显著下调。2.KEGG分析显示富集214条上调信号通路,108条下调信号通路,糖酵解/糖异生、MAPK信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等与有氧糖酵解和炎症相关的信号通路显著下调。3.HK2-sh RNA预处理后RT-PCR结果显示Cxcl2和Eph A2 m RNA的表达显著下调。第四部分有氧糖酵解通过Eph A2/p38 MAPK通路介导Aβ1-42诱导BV2细胞炎症反应目的:以小鼠小胶质细胞系BV2细胞为研究对象,分析HK2-sh RNA预处理BV2细胞后Aβ1-42对Eph A2、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）MAPK、细胞外信号调节激酶（Extracellular-signalregulated protein kinase,Erk）MAPK、p38 MAPK磷酸化蛋白和总蛋白表达的影响。随后分析Eph A2-si RNA预处理BV2细胞后Aβ1-42对Eph A2、p38 MAPK磷酸化蛋白和总蛋白及炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响。方法:通过Western blot实验检测HK2-sh RNA预处理BV2细胞后Aβ1-42对Eph A2、JNK MAPK、Erk MAPK、p38 MAPK磷酸化蛋白和总蛋白表达的影响;通过Western blot实验检测Eph A2-si RNA预处理对BV2细胞的感染效率,并通过Western blot实验检测Eph A2和p38 MAPK磷酸化蛋白和总蛋白及炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白的表达。结果:Western blot实验结果显示,与Con组相比,HK2-sh RNA预处理BV2细胞中Eph A2蛋白、p38 MAPK磷酸化蛋白的表达显著降低,但Erk1/2和JNK磷酸化和总蛋白水平未见显著变化;Western blot实验结果显示Eph A2-si RNA预处理BV2细胞中Eph A2蛋白水平表达显著降低,p38 MAPK磷酸化蛋白和炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白的表达显著降低。结论:1.抑制BV2细胞有氧糖酵解后显著下调Aβ1-42对Eph A2蛋白、p38MAPK磷酸化蛋白表达的促进作用。2.敲低Eph A2后显著下调Aβ1-42对BV2细胞Eph A2蛋白、p38 MAPK磷酸化蛋白和炎症因子表达的促进作用。3.Aβ1-42诱导有氧糖酵解过程通过Eph A2/p38 MAPK信号通路调控BV2细胞炎症因子的表达。