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目的:Clp蛋白酶广泛存在于各种生物体,尤其是低GC含量的革兰阳性菌中。研究发现在外界应激条件下,Clp蛋白酶可以通过重新折叠或降解的方式,对错误折叠并累积的蛋白质进行修正或者清除。研究发现,Clp蛋白酶由催化亚基和调节亚基构成,其中催化亚基为含有丝氨酸蛋白酶活性位点的Clp P蛋白,调节亚基为存在于细菌中高度保守的Clp ATP酶。Clp C作为Clp ATP酶的重要成员之一,可与Clp P蛋白发生特异性结合形成Clp CP,参与由Mcs AB介导的热休克蛋白Cts R的降解。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)中,Clp CP蛋白酶可借由Mec A蛋白的介导参与其感受态形成系统Com K/S的转录,调控B.subtilis感受态细胞的形成。研究证实,变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)与B.subtilis同为低GC含量的革兰阳性菌,且Clp蛋白水解系统具有较高的同源性。同源性比对证实,变异链球菌中存在着Clp P和五种Clp ATP酶,包括:Clp B、Clp C、Clp E、Clp L和Clp X。因此,本研究拟构建变异链球菌S.mutans的clp P/clp C基因缺陷株,并通过细菌形态、生长曲线、平板生存试验、适应性耐药、生物膜形成试验、感受态基因表达测定、感受肽细胞转化率等初步探讨Clp蛋白酶在变异链球菌应激耐受中的作用及其相关机制。方法:(1)本研究以变异链球菌UA159作为实验菌株,PCR扩增clp P、clp C基因片段,分别插入p MD-19T simple克隆载体,并连入卡那霉素抗性基因盒(lox71-kan-lox66),从而构建clp P和clp C缺失同源重组载体p CKX3和p CKX4。(2)在感受态刺激肽(competence-stimulating peptide,CSP)作用下,将线性化的p CKX3和p CKX4分别转化变异链球菌UA159,获得Dclp C::kan和Dclp P::kan菌株,同样方法转化热敏质粒p Cre PA,37℃培养去除p Cre PA并获得无标记缺陷株SM-Dclp P和SM-Dclp C。(3)PCR扩增clp P基因开放阅读框(open reading frame,ORF)及其5’UTR,插入p Ori23并转化SM-Dclp P突变菌株,获得补偿株Sclp P。(4)以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,观察各菌株的生长情况。(5)以p H5.0、6.0、8.0和1%Na Cl、2.5%Na Cl的THY平板进行生存测试,比较各菌株的生存能力。(6)将各菌株分别培养于0.5%葡萄糖的THY液和0.5%蔗糖的THY液48h,蒸馏水洗涤后采用结晶紫染色并用荧光相差显微镜观察生物膜形成情况;以乙醇:丙酮=8:2的洗涤液进行洗脱附着染料并检测其A575的吸光度值。(7)利用传统的KB法进行药敏实验,比较各菌株的适应性耐药情况。(8)在CSP诱导下,将穿梭质粒p DL276分别转化S.mutans UA159和Dclp C缺陷株,观察其感受态转化率的影响。(9)利用Trizol法分别抽提CSP诱导下各菌株的总RNA,Real-time PCR检测感受态基因com X、cin A、com YA的表达情况。结果:(1)经PCR、酶切及DNA测序证明,成功构建同源重组载体p CKX3、p CKX4和变异链球菌无标记SM-Dclp P和SM-Dclp C缺陷株。(2)经PCR和测序证明,成功构建补偿质粒p CKX5和补偿菌株Sclp P。(3)37℃CO2培养箱培养条件下,SM-Dclp P的生长速度明显低于野生株,补偿菌株Sclp P的生长速度介于野生株和SM-Dclp P之间,但并未恢复到野生株的水平;而42℃CO2培养箱培养条件下SM-Dclp C的生长速度明显高于野生株,SM-Dclp P生长明显低下。(4)菌落数观察,clp P缺陷株表现出对酸碱和氯化钠的抵抗能力明显下降;补偿菌株的耐酸碱盐的能力恢复接近野生株水平。(5)细菌在蔗糖培养液中的生物膜形成能力明显强于葡萄糖培养液;在0.5%Glucose THY培养基中clp P缺陷菌株的生物膜形成能力严重受损是野生株的42%;0.5%Sucrose THY培养基中clp P缺陷菌株的生物膜形成能力反而成倍增长是野生株的1.74倍;clp C基因基本不影响细菌生物膜的形成。(6)与野生株相比,clp P缺陷株对抗生素的敏感性增加;clp C缺陷株的抗生素敏感性无明显变化。(7)CSP诱导下,野生株的感受态转化增长速率较快,50min~90min达到增长高峰;SM-Dclp C于120min~150min时达到最高峰,并且延长中晚期感受态细胞的维持期。(8)经Real-time PCR检测:与野生菌株相比,SM-Dclp P菌株的晚期感受态基因com YA表达量上升2.007倍,而cin A、com X分别下降为73%和58.2%;SM-Dclp C的感受态基因com YA、cin A和com X的表达量分别上升8.34倍、2.99倍和1.608倍。结论:Clp蛋白酶在维持变异链球菌内环境稳态及调控其致病方面发挥着重要的作用,参与调控细菌形态的变化、生物膜形成、抗外环境应激、适应性耐药以及感受肽细胞形成能力等。