桑椹是桑树的果实,其含有多种人体必需氨基酸、维生素和矿物质,并且能够有效地提高人体免疫力,具有很大的开发利用价值。桑椹菌核病是桑椹生产中危害性最高的一种真菌病害,每年都会给桑椹生产带来巨大影响,进而导致巨额经济损失。桑椹肥大性菌核病是影响桑椹生产最主要的真菌病害,它是由死体型病原真菌桑实杯盘菌侵染而引起的。桑实杯盘菌为丝状真菌,菌丝生长聚集缠绕形成黑色菌核,帮助桑实杯盘菌抵御外界不良环境,同时菌核也是次年侵染宿主植物的侵染源,因此对菌核形成进行研究将有利于对桑椹菌核病的防治。而APSES蛋白家族是一种真菌特异性转录因子,在真菌的生长发育、次生代谢产物合成和致病性等方面都发挥着关键的调控作用,因此开展有关桑实杯盘菌中APSES类转录因子家族的研究极具价值。1、桑实杯盘菌中APSES类基因家族的鉴定与信息分析利用信息学方法,我们在桑实杯盘菌基因组数据中找到4个APSES类转录因子。根据与其他物种的同源性,将这四个基因分别命名为Cs Stu A、Cs Mbp1、Cs Swi6、CsXbp1。这四个基因都含有保守的APSES类DNA结合域,进化分析分为4支,桑实杯盘菌4个APSES类转录因子分属于4个不同支系中,且均与核盘菌、灰霉菌中的同源基因亲缘关系较近。多序列比对分析发现桑实杯盘菌中4个APSES类转录因子成员中的结构域之间保守性较低,不足10%。从系统进化和序列对比结果推测出桑实杯盘菌中4个APSES类转录因子成员之间的功能存在差异与分化。2、桑实杯盘菌中CsXbp1基因的克隆及表达分析在桑实杯盘菌侵染番茄叶片实验中,4个APSES类转录因子均出现基因表达水平上调的现象。其中,在接种72 h后CsXbp1基因表达水平上升20多倍,推测该基因最有可能与桑实杯盘菌的致病力相关。因此我们选取了CsXbp1基因展开后续相关研究。首先我们在桑实杯盘菌菌丝中成功克隆得到CsXbp1基因,CsXbp1基因全长1842 bp,编码614个氨基酸。该蛋白的第120-251氨基酸区域为APSES类DNA结合域。之后对其基因在不同组织中的表达模式进行分析,结果表明CsXbp1基因在菌丝、菌核、子囊盘、分生孢子中均有表达,其中在菌核中相对表达量最高。酵母转录激活实验表明CsXbp1具有转录激活活性,亚细胞定位实验表明CsXbp1蛋白定位在细胞核中,这些结果与其转录因子功能是相一致的。3、桑实杯盘菌中CsXbp1基因生物学功能分析本研究使用原生质体转化法将构建成功的基因沉默载体转入桑实杯盘菌基因组中,在潮霉素抗性平板上连续纯化筛选3代后获得阳性菌落,再以基因组DNA为模板扩增潮霉素基因筛选阳性菌落,继而通过q RT-PCR检测转化子中CsXbp1基因的表达量。实验结果显示沉默转化子中CsXbp1基因表达量与野生型相比下调了60-80%。从中选取三株沉默转化子进行表型观察实验,结果发现:（1）在生长发育方面,CsXbp1基因RNAi突变体菌丝生长变得缓慢,形成的菌核体积较大但在数量和总干重上均减少30-50%;（2）在致病力方面,沉默突变体虽能诱导形成侵染垫,但形成的侵染垫数目减少,对离体烟草叶片致病力下降90%;（3）在非生物胁迫方面,沉默突变体对过氧化氢胁迫更为敏感,说明CsXbp1基因可能参与氧化胁迫过程。本研究首次在植物病原真菌中对APSES类转录因子CsXbp1基因功能进行研究。对实验结果分析CsXbp1基因参与桑实杯盘菌生活史中最为关键的一环-菌核的形成,同时也影响桑实杯盘菌的侵染宿主植物的能力。本研究初步筛选所得到的致病基因,有助于更完善地解析桑实杯盘菌的致病机制,该基因也可用作防治桑椹菌核病的分子靶标,为防治桑椹菌核病的药物开发提供理论基础。