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动态DNA结构能够响应环境刺激并对其构象进行重新配置,被广泛应用于功能性纳米器件的研究中,如构建分子机器、生物传感器和分子逻辑门等。利用碱基堆积力驱动DNA结构的运动是构建动态DNA结构的新思路,但目前基于碱基堆积力驱动的动态DNA结构的研究数目较为有限。我们利用Holliday交叉结结构设计了一种碱基堆积力驱动的DNA分子器件,通过使单链DNA分子作为输入（input）与结构边缘区域链杂交,触发交叉位点在碱基堆积力的驱动下发生构象变化。本研究中,我们通过在DNA分子器件中引入荧光报告区域,使用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）信号对其构象变化进行表征。我们还对DNA分子器件的信号响应功能进行优化,并构建了可执行不同布尔运算的分子逻辑门。目的:1.设计两种不同结构的分子器件（DCA-A和DCA-B）,并对两者结构稳定性进行比较,确定分子器件结构的设计原则。2.输入DNA链与DNA分子器件作用,使分子器件具有预测的构象变化的趋势,并优化其荧光信号响应功能。3.在应用方面,利用不同输入情况下荧光响应信号的显著差异建立二进制信号,设计并构建分子逻辑门。方法:1.采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denaturing PAGE）对DNA单链引物进行纯度验证和纯化。2.采用DNA连接反应合成DCA-B结构中的骨架链（scaffold）:利用T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase,T4 PNK）催化DNA单链5’端磷酸化,加入辅助链与DNA单链片段退火形成复合物,并利用T4 DNA连接酶催化DNA片段连接处的切口形成磷酸二酯键,从而将较短DNA片段连接为长链DNA。3.使用DNA模拟分析软件Tiamat和IDT网站（https://sg.idtdna.com/pages）设计DNA分子器件的结构和DNA序列。4.将组成目标结构的各条单链DNA混合于TAE/Mg2+缓冲液中,设置温度控制程序,经过高温变性然缓慢冷却复性,使DNA单链通过特异性碱基互补配对自组装成设计的结构。5.采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）表征DNA自组装结构的形成。6.使用原子力显微镜（atomic force microscope,AFM）对DNA分子器件的形态进行观测。7.采用荧光光谱分析对修饰有荧光基团的DNA分子器件的构象变化进行表征,结合福斯特理论对DNA分子器件荧光供体与受体之间距离进行计算;并利用荧光响应信号的变化指导DNA分子器件起始结构的设计,对DNA分子器件的荧光响应信号进行优化。8.通过预先输入不同的设置链与分子器件在不同结合位点组装并设定DNA分子器件的起始构象,并根据不同输入情况产生的DNA分子器件的荧光响应的显著差异,建立二进制信号,从而设置DNA分子器件所执行的布尔逻辑,构建不同种类的分子逻辑门。结果:1.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳数据显示,利用DNA连接反应法,骨架链成功地由三条DNA链片段连接形成,经过纯化回收之后产率达到34.9%。2.根据非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现的结果,对于DCA-A和DCA-B这两种不同结构的分子器件,我们采用分步组装的方式表征了其结构的形成。但是当加入输入链分别与分子器件孵育后,DCA-A体系中产生了大量错误的互补配对,说明DCA-A结构稳定性较差并且对序列设计的要求较高。相比之下,DCA-B与输入链组装形成的目标产物产率高,说明DCA-B的类似DNA折纸的设计大大增强了分子器件结构的稳定性。3.原子力显微镜成像结果显示,DCA起始结构的几何形状为菱形,交叉处呈现一定角度。4.荧光测试的结果显示,不同方向的输入链对分子器件具有相反的作用效果,分子器件构象的运动趋势的变化符合预期;但是不同方向的输入链对分子器件作用产生的信号强度不同,表现为西南（SW）方向>西北（NW）方向>东南（SE）方向,并且SW方向上的输入提供的强度覆盖了NW、SE方向上单独输入的强度。5.通过改变分子器件的结构,并缩短SW方向输入链序列使之对分子器件的作用强度减弱,NW、SE、SW三个方向上的输入链对分子器件的作用强度被校正至大致等同,并且分子器件对应各输入产生的荧光强度持平、下降和上升三种响应信号具有足够的区分度。6.基于福斯特理论,我们计算了各输入情况下DNA分子器件的荧光供体与荧光受体之间的距离r,从而获得DNA分子器件的具体构象。7.荧光测试的结果显示,DNA分子器件成功地执行了与门（AND gate）和非门（NOT gate）的信号响应功能。结论:本论文设计并构建了一种碱基堆积力驱动的DNA纳米器件,并以荧光分析法表征其构象的可控变化。DNA分子器件具有模块化的特性,可在基本结构的输入端互补不同长度的DNA链以设计不同的起始结构,从而对其信号响应功能进行调整,研究中我们优化了分子器件的设计,并根据丰富的信号响应功能构建不同的分子逻辑门。对于DNA分子器件的潜在应用方面,可以设计序列与作为被分析物的核酸分子互补,构建用以识别核酸的生物传感器或疾病检测设备;或将不同的分子逻辑门模块整合,构建更加复杂的分子运算系统。