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乳腺癌目前已成为女性发病率第一位的恶性肿瘤，其死亡率也已上升至第2位。原位乳腺癌并不致命，转移并侵袭其它器官是其致死最重要的原因。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肿瘤发生转移的关键步骤。ID2蛋白，（Inhibitor of DNA binding2，或Inhibitor of differentiation2）属于HLH（Helix-Loop-Helix）蛋白分子家族一员，在调节增殖分化、凋亡衰老、肿瘤形成等过程中有重要作用。ID2基因的缺失将导致乳腺腺泡上皮的分化的阻滞，多项研究表明ID2在小鼠乳腺上皮EMT模型中通过不同途径抑制EMT的转化过程，在人乳腺癌ID2也被报导与其侵袭性及EMT负相关关系。E2A蛋白由 tcf3基因编码，经不同剪切形成 E12和 E47两个亚蛋白，属 bHLH（basic Helix-Loop-Helix）蛋白家族成员之一，通常以同源二聚体形式作用于靶基因启动子序列的E-box结构域在转录水平发挥促进或抑制作用。E2A在生命的多个过程起重要作用，尤其在淋巴系统的发育中作用不可缺失，E2A对肿瘤的EMT过程作用的研究报导E2A有直接抑制E-ca表达促进EMT的作用，ID1/ID2/ID3则被报导有拮抗E2A的抑制E-ca转录的作用。NOTCH3蛋白属NOTCH家族一员，其信号通路在维持干细胞干性、决定细胞命运、细胞分化、增殖、肿瘤形成及上皮间质转化等过程中起重要作用。有多篇文献报导NOTCH3在多种肿瘤 EMT转化过程中的作用，本实验室前期研究也已发现 NOTCH3可通过上调GATA-3、ERα，抑制乳腺癌EMT的进展。因此我们推测ID2与NOTCH3也许在乳腺癌的EMT过程中存在相关关系并影响作用于乳腺癌EMT进展。在淋巴T细胞分化过程中有文章报导E2A与ID3共同在mRNA水平调控NOTCH1的表达精确调控着T细胞的分化发育，因此进一步我们推测E2A蛋白可能参与ID2与NOTCH3之间的调控机制。基于以上研究背景，我们推测在乳腺癌中ID2与NOTCH3也许在乳腺癌的EMT过程中存在相关关系，且E2A在 mRNA水平参与一定的调控。本研究主要采用RNA干扰和质粒转染、免疫印迹、荧光定量PCR、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀以及迁移和侵袭实验等技术方法全面分析ID2、E2A与NOTCH3在乳腺癌上皮细胞的EMT中的作用及它们的调控关系。 首先我们利用五株乳腺癌细胞系检测ID2及NOTCH3的表达。结果显示：在ERα阳性表达的 MCF-7细胞中 ID2与 NOTCH3的表达较高，而 ERα阴性表达细胞的MDA-MB-231、SKBR3细胞表达较低，这提示ID2与NOTCH3在乳腺癌细胞株表达存在一定的正相关性。 为了分析ID2与NOTCH3在乳腺癌EMT中的生物学意义，我们通过瞬时敲减id2的MCF-7细胞株，观察到细胞的形态由上皮样改变为间质样；同时构建稳定高表达 ID2的MDA-MB-231细胞株，观察到细胞形态从间质样改变为上皮样。迁移及侵袭实验结果表明：瞬时敲减id2的MCF-7细胞株的迁移、侵袭能力增强，而重新高表达NOTCH3后，其迁移、侵袭能力恢复。相反地，在稳定高表达 ID2的MDA-MB-231细胞株其迁移、侵袭能力减弱，在此基础上进一步敲减notch3，其迁移、侵袭能力恢复。这些功能实验的结果表明ID2可能通过NOTCH3抑制乳腺癌细胞的EMT。 为了明确ID2与NOTCH3的关系，在分子水平，我们分别在沉默id2的MCF-7细胞株和高表达ID2的MDA-MB-231细胞株中检测NOTCH3及EMT相关因子的表达。结果显示：1）在沉默内源性id2的MCF-7细胞株中，NOTCH3、E-cad的mRNA及蛋白表达下调，Vimentin的mRNA及蛋白表达上调；2）高表达外源性ID2的MDA-MB-231细胞株， NOTCH3、E-cad的mRNA及蛋白表达上调，Vimentin的mRNA及蛋白表达下调。这些结果表明ID2正向调控NOTCH3的表达，并可上调E-cad表达下调Vimentin表达。 进一步探讨ID2调控NOTCH3的机制，我们考虑是否存在ID2与E2A共同调控Notch3启动子转录活性，因此我们在MCF-7和MDA-MB-231细胞系中沉默内源性tcf3及高表达外源性E12和E47检测NOTCH3表达，并通过染色质免疫共沉淀、双荧光报告基因检测和蛋白免疫共沉淀反应来探讨E2A与ID2在NOTCH3转录水平的调控机制。结果显示：1） E2A可负向调控NOTCH3在mRNA及蛋白水平表达；2）染色质免疫沉淀实验发现E2A能直接结合到 notch3的启动子区；3）双荧光报告基因检测证实 E2A负向调控 NOTCH3启动子活性；4）免疫共沉淀反应发现ID2可直接与E2A蛋白结合。这些结果表明E2A负向调控Notch3启动子活性，而ID2可能通过直接与E2A形成异二聚体拮抗E2A作用。 综上所述，本研究可以得出：ID2通过抑制E2A负性调节NOTCH3启动子活性作用从而上调NOTCH3表达抑制乳腺癌上皮间质转。该研究丰富了乳腺癌EMT调控理论，为控制乳腺癌的转移与复发奠定了理论与实验基础。