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目的1、观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)对表皮生长因子(EGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响,同时观察PI3Ks对肌动蛋白结合蛋白Twinfilin-1的影响及Twinfilin-1对细胞骨架重塑的调节。2、观察软脉灵药物血清对血小板源性生长因子(PDGF)诱导的VSMCs内Twinfilin-1和细胞骨架的的影响。方法第一部分组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,第3-5代细胞用于实验,细胞做如下方法处理:空白对照(Control组)、25ng/ml EGF(EGF组)及5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L PI3Ks阻滞剂LY294002(LY294002低、中、高浓度组),后三组在实验时先以相应浓度LY294002预处理细胞1h,再加入同浓度EGF干预。用划痕损伤法观察细胞迁移情况,记录下EGF诱导后第0,6,12h VSMCs细胞间“裸露”区域面积,转化成相对值(%)。EGF诱导6h后,以Western blot法检测细胞内Twinfilin-1的表达水平,用激光共聚焦显微镜观察细胞内Twinfilin-1分布及细胞骨架微丝排列变化。第二部分灌胃法制备大鼠软脉灵药物及非药物血清,组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,第3-5代细胞用于实验,实验分为空白对照(Control)、PDGF(10ng/ml)、10%软脉灵药物血清+PDGF、10%非药物血清+PDGF及LY294002(50μmol/L)+PDGF五组,后三组在实验时先以相应药物预处理细胞1h,再加入同浓度PDGF干预。在干预第6h时以激光共聚焦显微镜观察细胞内Twinfilin-1表达和分布情况及微丝排列变化。结果第一部分划痕后6h、12h,与Control相比,25ng/ml EGF明显促进细胞迁移(细胞间“裸露”区域的面积相对值/%,6h:EGF 73.33±2.83 vs Control 92.14±4.34;12h:EGF 44.77±4.23 vs Control 82.96±2.67,均P<0.01)。LY294002呈浓度依赖性抑制EGF诱导的VSMCs迁移(5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L预处理后细胞“裸露”区域面积相对值/%依次为:6h:78.93±2.52,85.86±3.16,90.27±2.78;12h:54.63±3.30,70.59±2.91,81.13±3.03;均P<0.01vs EGF)。与Control相比,EGF诱导VSMCs内Twinfilin-1表达增多,LY294002呈浓度依赖性抑制Twinfilin-1表达。激光共聚焦观察到在静息状态下细胞内Twinfilin-1表达较少,可见核周聚集的现象,余胞质内均匀弥散分布,细胞内肌动蛋白纤维丝少,丝状伪足不明显。EGF诱导细胞后Twinfilin-1表达增多并重新分布,表现为核周聚集现象减弱,均匀弥散到整个细胞质中特别在细胞伪足伸出处定位;同时细胞内应力纤维明显增多,排列整齐有序,细胞伸出小伪足。LY294002呈浓度依赖性抑制Twinfilin-1表达与重定位,核周聚集现象虽不如Control组明显但开始出现了核周聚集的趋势;同时细胞内应力纤维减少,肌动蛋白纤维丝排列杂乱无序,丝状伪足不明显。LY294002浓度越大,肌动蛋白纤维丝排列越松散无序。第二部分Control组内Twinfilin-1主要聚集在核周,余胞质内少量均匀分布,细胞骨架重塑情况不明显,未见到明显的应力纤维。PDGF诱导细胞后Twinfilin-1表达增多,在细胞突起和细胞伪足处可见到Twinfilin-1分布;同时细胞骨架重组,胞内应力纤维明显增多,排列整齐有序,延伸至细胞伪足处。软脉灵药物血清干预细胞后,Twinfilin-1表达较非药物血清组减弱,并且重定位现象受抑制,Twinfilin-1未定位到细胞突起及伪足处;同时细胞骨架微丝减少,排列松散,伪足处应力纤维减少,与LY294002干预情况相似。结论1、EGF通过PI3Ks通路促进血管平滑肌细胞迁移,诱导细胞内Twinfilin-1表达和重分布。2、Twinfilin-1表达与重分布伴随细胞骨架肌动蛋白纤维丝结构的重塑。3、软脉灵药物血清可抑制PDGF诱导的Twinfilin-1表达及重分布,抑制细胞骨架的重塑。