研究背景和目的胃癌（gastric cancer,GC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率居第五位,死亡率高居第三位。在我国,高达80%的胃癌患者首诊处于进展期,此时手术和化疗对患者整体生存改善的作用并不明显,五年生存率不足40%。在精准医学时代背景下,分子靶向治疗为更多的进展期胃癌患者带来了希望。人表皮生长因子受体 2（Human epidermal growth factor receptor 2,Her2）在胃癌患者中的阳性率约12%-20%。曲妥珠单抗是针对Her2受体细胞膜外部分的单克隆抗体,其联合化疗可显著延长Her2阳性进展期胃癌患者的总生存期及无进展生存期,是目前NCCN指南中唯一推荐用于局部晚期或转移性胃癌一线治疗的单抗药物。然而,使用曲妥珠单抗治疗的患者在治疗1年内几乎都出现了病情进展;即使初始治疗有效,在6-12月后曲妥珠单抗获得性耐药的比例几乎达到100%。曲妥珠单抗耐药已经成为限制其临床疗效的主要障碍,至今仍未能为克服其耐药提供可靠的解决方案。因此,进一步加强胃癌曲妥珠单抗耐药机制的研究,寻找可靠的抑制耐药新策略,对提高胃癌靶向治疗的敏感性,改善预后具有重要意义。研究方法:1.收集整理本单位HER2阳性胃癌病人PET-CT资料,并根据临床疗效将使用曲妥珠单抗治疗的病人分为曲妥珠单抗治疗敏感组和耐药组,并计算分析病灶SUVmax,对SUVmax值与患者OS、DFS相关性进行生存分析;分别对其组织进行TUNEL染色明确其凋亡水平改变;2.选取HER2阳性表达细胞,采取逐步增加剂量法诱导构建曲妥珠单抗耐药细胞株,通过流式细胞技术检测细胞株的葡萄糖吸收能力变化;利用比色法检测细胞上清中葡萄糖及乳酸含量;检测细胞耐药前后ECAR胞外酸化率、OCR氧消耗率改变;利用Q-PCR及Western blot检测糖代谢通路相关关键酶mRNA以及蛋白质水平表达变化;通过MTT检测细胞在乏氧和/或低糖条件下对曲妥珠单抗敏感性的变化;进一步,将敏感株细胞以及耐药细胞进行裸鼠皮下成瘤,并通过micro-PET-CT和免疫组织化学等方法检测耐药前后肿瘤增殖及代谢水平变化;3.通过转录组测序的方法筛选出细胞耐药后高表达基因PFKFB3,利用IHC-P方法明确PFKFB3在耐药组织中表达变化,并分析其表达水平与HER2阳性胃癌患者OS、DFS相关性;进一步通过siRNA干扰其表达、过表达质粒瞬时转染过表达的方法检测其对糖代谢通路上下游相关关键酶表达的影响;通过流式细胞技术检测干扰或过表达细胞株该基因后2-NBDG葡萄糖吸收能力变化;利用比色法检测细胞上清中葡萄糖及乳酸含量改变;检测细胞干扰或过表达PFKFB3后细胞能量代谢改变;MTT检测改变该基因表达后对曲妥珠单抗治疗敏感性变化;划痕实验、CCK8以及克隆形成实验验证PFKFB3对细胞株侵袭迁移、增殖能力的影响;设计并合成PFKFB3腺相关病毒shAAV-PFKFB3,与曲妥珠单抗联合治疗HER2阳性胃癌细胞裸鼠皮下成瘤动物,IHC-P、PET-CT检测各组组织糖代谢水平变化;4.分别用敏感与耐药细胞株培养上清诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过小管形成实验检测血管生成能力的变化、Q-PCR检测血管异常化相关指标mRNA水平变化;进一步,利用耐药细胞干扰PFKFB3后上清处理HUVEC检测对体外成管的影响;构建敏感、耐药以及干扰耐药细胞PFKFB3的裸鼠皮下成瘤模型,利用shAAV-PFKFB3联合曲妥珠单抗治疗各组,通过扫描电镜观察各组血管结构改变,并对皮下瘤组织进行CD31标记的血管与VE-Cadherin、a-SMA、Collagen Ⅳ、PDGFRB等免疫荧光共染明确肿瘤有效血管数量变化、基膜改变、周细胞覆盖等结构变化;肿瘤血管灌注及渗漏实验验证肿瘤内血管有效功能的变化:5.利用液相芯片的方法鉴定过表达PFKFB3 后趋化因子CXC以及CCL家族表达变化并筛选出趋化因子CXCL8;通过查询TCGA、GSEA等数据库并结合 Q-PCR、Western blot、IHC-P 共聚焦、CoIP、IF 等方法初步明确 PFKFB3 与CXCL8直接的相互调控及相互作用关系;进一步,构建过表达PFKFB3敏感株细胞裸鼠皮下成瘤模型,并联合CXCL8抑制剂后,通过免疫荧光染色明确CXCL8抑制剂对PFKFB3过表达后肿瘤组织中血管结构和功能的影响;6.通过磷酸化质谱的方法筛选过表达PFKFB3后下游底物磷酸化位点Smad S425;利用TCGA和GESA数据库探寻PFKFB3与Smad S425位点磷酸化的相互调控关系;进一步用Q-PCR、Western blot、CoIP、激光共聚焦以及Smad3 S425位点突变等方法验证PFKFB3与Smad S425位点磷酸化的相互作用关系;查询JASPAR网站并预测Smad3与CXCL8启动子区相互结合位点;利用Western blot、CoIP、ChIP、双荧光素报告基因实验验证Smad3与CXCL8启动子区相互结合关系及相互调控关系;通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测Smad3质粒和Smad3 S425A突变质粒过表达胃癌细胞株后CXCL8胞外分泌水平变化;最后通过回复实验证实胃癌细胞通过PFKFB3-Smad3 S425-CXCL8轴介导耐药。研究结果:1.胃癌细胞曲妥珠单抗耐药后糖代谢重组水平增强通过对HER2阳性胃癌患者的生存预后数据进行回访发现,高水平FDG与患者的不良预后成正相关关系。TUNEL染色则发现耐药组凋亡水平显著低于敏感组。为了进一步研究耐药机制,我们通过逐步增加剂量法成功构建曲妥珠单抗耐药细胞株NCI-N87TR。研究发现,不论在正常还是缺氧条件下,细胞耐药后葡萄糖消耗、摄取及乳酸产量均有效提升,同时乳酸（Lactate）、丙酮酸（Pyruvate）及3-磷酸甘油醛（GA3P）等糖酵解中间产物在耐药细胞中显著聚积;ECAR以及OCR检测发现耐药后细胞的胞外产酸能力增加,糖酵解能力增强且耗氧量降低。进一步我们发现,在低葡萄糖条件下,无论的培养环境中氧气是否充足,相较于敏感株细胞,耐药细胞株细胞生存能力均被明显抑制,证实耐药细胞株对于葡萄糖的需求明显高于敏感株。随后通过对葡萄糖代谢酶的mRNA及蛋白表达水平进行验证,结果发现耐药后糖酵解通路关键酶表达上调。裸鼠皮下成瘤实验则证实,体内耐药肿瘤增殖增快、糖代谢水平增高。这提示胃癌高糖代谢水平与患者曲妥珠单抗治疗耐药密切相关。2.PFKFB3表达增高促进胃癌糖代谢重组诱导曲妥珠单抗耐药在前期工作中,我们对构建成功的HER2阳性胃癌细胞NCI-N87耐药细胞株与野生敏感株细胞进行转录组测序分析发现,耐药株细胞中PFKFB3基因上调。通过Western blot、免疫组化分析验证PFKFB3在耐药组细胞及组织中表达增高,且PFKFB3表达增高与HER2阳性胃癌患者不良预后成正相关关系。敲低耐药细胞PFKFB3后,细胞株葡萄糖摄取、乳酸产量、胞外酸化率下降,细胞株侵袭迁移、增殖等功能降低。此外,耐药细胞株敲低PFKFB3后对曲妥珠单抗的治疗敏感性恢复。在体内,PFKFB3-AAV联合曲妥珠单抗可有效增强曲妥珠单抗对NCI-N87裸鼠皮下成瘤组织的治疗敏感性。3.PFKFB3通过调控肿瘤血管异常化诱导HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药在前期研究中,我们通过对CD31标记的肿瘤血管与血管结构相关指标VE-Cadherin、a-SMA、PDGFRB 和 Collagen Ⅳ 共染后发现,PFKFB3-AAV 联合曲妥珠单抗治疗组肿瘤血管结构得到恢复。因此,我们猜想,阻断PFKFB3可通过促进肿瘤血管异常化降低曲妥珠单抗治疗敏感性。在体外研究中,PFKFB3敲低的NCI-N87TR细胞株与HUVEC共培养后,我们对HUVEC相关mRNA指标进行验证,Q-PCR结果显示正常血管相关指标表达增高,而异常相关指标如VEGF2等表达显著降低。而PFKFB3过表达敏感株细胞与HUVEC共培养后结果则相反。在体内,PFKFB3过表达NCI-N87细胞裸鼠皮下成瘤组织CD31标记的肿瘤血管与血管结构相关指标免疫荧光双染、扫描电镜及灌注、渗漏实验证实,PFKFB3高表达胃癌组织肿瘤血管结构及功能异常加剧。4.PFKFB3通过调控CXCL8胞外分泌调控肿瘤血管异常化为进一步明确PFKFB3调控肿瘤血管异常的机制,我们通过液相芯片发现,细胞过表达PFKFB3后CXCL8的分泌增多。利用Q-PCR、Western blot、IHC-P、Elisa、生物信息学等方法发现PFKFB3可以促进CXCL8的表达及胞外分泌,而CoIP及激光共聚焦发现PFKFB3可与CXCL8在胞浆及胞核存在共定位及相互作用关系。此外,IHC-P联合患者生存资料分析发现,CXCL8表达增高与HER2阳性胃癌患者不良预后成正相关关系。进一步,CXCL8重组蛋白与HUVECs共培养后可显著降低正常血管相关指标的mRNA水平变化而增加异常血管相关指标的表达水平,而CXCL8抑制剂可以有效地逆转相关mRNA表达。在体内,PFKFB3高表达胃癌细胞裸鼠皮下成瘤组织经CXCL8抑制剂处理后,CD31标记的正常血管指标免疫荧光、扫描电镜及灌注、渗漏皆证实,CXCL8抑制剂可有效恢复PFKFB3诱导的血管正常化,增强曲妥珠单抗的治疗敏感性。5.PFKFB3激酶可促进Smad3 S425位点磷酸化诱导CXCL8表达及胞外分泌为进一步阐述PFKFB3调控CXCL8表达增高及胞外分泌的机制,结合激光共聚焦免疫荧光共定位染色发现耐药后PFKFB3、CXCL8存在明显的共定位现象。进一步,利用磷酸化修饰组学进行探究,结果表明,过表达PFKFB3后的胃癌细胞蛋白纯化可以诱导多种底物的磷酸化,其中Smad3 S425位点趋势最为显著。通过过表达质粒验证,过表达PFKFB3后胃癌细胞Smad3 S425位点磷酸化增强。转染Smad3 S425A位点突变质粒后,PFKFB3对Smad3的磷酸化作用减弱甚至消失。进一步,我们通过生物信息学的方法预测发现,Smad3作为转录因子可通过结合CXCL8启动子区。CoIP、双荧光素酶实验以及ChIP实验发现Smad3可直接结合在CXCL8的启动子区促进其转录活性。恢复实验进一步证实,PFKFB3与Smad3 S425A位点突变质粒共同转染胃癌细胞后,CXCL8转录水平、蛋白水平及胞外分泌减少。而敲低PFKFB3的同时过表达Smad3 S425质粒后CXCL8转录水平、蛋白水平及胞外分泌增加。研究结论:1.HER2阳性胃癌糖代谢重组与曲妥珠单抗耐药密切相关;2.PFKFB3可通过胃癌细胞糖代谢重组促进细胞增殖诱导HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药;3.阻断PFKFB3可有效增强HER2阳性胃癌曲妥珠单抗治疗敏感性;4.PFKFB3通过调控肿瘤血管异常化诱导HER2阳性胃癌曲妥珠单抗耐药;5.PFKFB3可通过增加CXCL8表达增高及胞外分泌调控肿瘤血管异常化;6.PFKFB3可通过促进底物Smad3 S425位点磷酸化激活其转录活性,后者通过直接结合在CXCL8的启动子区促进其转录及胞外分泌