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香蕉枯萎病是世界香蕉生产的毁灭性病害,要消除香蕉枯萎病等病害对香蕉产业的威胁,根本出路在于培育抗病的品种。鉴于栽培香蕉主要是不结实的三倍体或多培体及其传统育种的艰难,香蕉抗病育种的突破寄希望于生物技术育种。而挖掘各种香蕉的抗病基因资源,克隆抗病基因是进行香蕉遗传改良的重要基础。
本研究首先利用基于rDNA内转录间隔区(ITS)的PCR-RFLP标记和RAPD技术对采自深圳的三种野生蕉遗传多样性进行了分析,并采用三个已报道与香蕉枯萎病相关的RAPD标记及苗期接种鉴定对其枯萎病的抗性进行了研究。研究结果表明野生蕉1号和3号为AA基因型:野生蕉2号为BB基因型。在遗传相似性系数为0.32处,可将同属.AA基因型的野生蕉1号和3号,与贡蕉(AA)和巴西蕉(AAA)聚为一类;基因型为BB的野生蕉2号,与基因型为ABB的粉蕉和大蕉聚为一类。与香蕉枯萎病相关的RAPD标记分析以及香蕉枯萎病早期诊断实验结果均表明野生蕉2号和3号感香蕉枯萎病,而野生蕉1号抗病。
采用同源序列克隆法分离野生蕉1号抗病基因类似序列。根据核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域(serine/threonine kinase domain)设计简并性引物,以野生蕉1号(Musa acuminata cv.Shenzhen 1(AA))叶片cDNA为模板进行PCR扩增。经过对扩增产物进行克隆和测序,获得了6个500bp左右的RGAs片段。其中有两个RGAs(WNB1和WNB2)具有NB-ARC保守结构域特征,并且WNB1具有连续的ORF。其余4个RGAs(WST1,WST2,WST3和WST4)均具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域特征,且LWST3编码的氨基酸序列与水稻抗叶斑病基因Xa21同源性很高。用半定量PCR分析枯萎病菌诱导后野生蕉叶片中RGAs的表达情况,结果表明WNB1和WST3受枯萎病菌诱导后表达量增强,这表明WNB1和WST3的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。
木质素作为细胞阻止病原入侵的第一道保护屏障,在植物防卫反应中起着重要作用,而苯丙氨酸解氨酶作为木质素合成途径的第一个关键酶,其作用非常重要。为了研究苯丙氨酸解氨酶基因在大蕉与枯萎病菌互作中的作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆了大蕉苯丙氨酸解氨酶基因全长cDNA。此cDNA长1300 bp,包含一个长为1191 bp,编码397个氨基酸的完整开放阅读框(ORF),推导的氨基酸序列与水稻PAL基因氨基酸序列同源性达89%,将此基因命名为M-PAL.
Southern杂交结果表明大蕉中存在一个包含4-5个PAL基因的基因家族,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32(a+)中,表达的蛋白质分子量大小与推导的相一致,并且表达的蛋白质表现出PAL酶活性。对接种香蕉枯萎病菌4号生理小种FOC race 4后大蕉叶片中M-PAL基因的转录谱进行研究表明,在接种枯萎病菌后M-PAL基因在叶片中的转录水平提高,因此推测M-PAL基因的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。