【摘 要】
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目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一,患者预后差,中位生存时间不足15个月。胶质瘤具有极强的血管侵袭性。近年研究发现,血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）的存在极大地限制了胶质瘤抗血管生成治疗的效果。本研究首先明确HNRNPD、ZHX2、linc00707、miR-651-3p、SP2与miR-876-5p和BPTF在胶质瘤组织和细胞中的内源性表达,进一
【基金项目】
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国家自然科学基金（81872503,82073403）；
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目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一,患者预后差,中位生存时间不足15个月。胶质瘤具有极强的血管侵袭性。近年研究发现,血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）的存在极大地限制了胶质瘤抗血管生成治疗的效果。本研究首先明确HNRNPD、ZHX2、linc00707、miR-651-3p、SP2与miR-876-5p和BPTF在胶质瘤组织和细胞中的内源性表达,进一步探讨上述因子间可能存在的调控机制及对胶质瘤细胞VM形成能力的影响,旨在从抗VM形成的角度,为脑胶质瘤的分子治疗提供新靶点和新思路。研究方法:首先培养人脑胶质瘤细胞U87、U251,人脑星型胶质细胞和人胚胎肾细胞HEK293T。应用qRT-PCR和Western blot技术分别检测linc00707、miR-651-3p和miR-876-5p,及HNRNPD、ZHX2、SP2、BPTF在人正常脑组织、胶质瘤组织、人脑星型胶质细胞和胶质瘤细胞中的表达。在胶质瘤细胞中稳定转染HNRNPD和linc00707的敲减质粒、ZHX2的过表达质粒、SP2和BPTF的过表达和敲减质粒,瞬时转染miR-651-3p的过表达和敲减质粒、miR-876-5p的过表达质粒及相应的阴性对照空载质粒。分别应用CCK-8、Transwell和体外三维管形成实验检测胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和VM形成能力。应用qRT-PCR和Western blot检测MMP2、MMP9和VE-cadherin的mRNA和蛋白的表达变化。应用RIP实验验证linc00707与miR-651-3p之间的结合作用。应用双荧光素酶报告基因分析系统验证HNRNPD与ZHX2 mRNA、linc00707与miR-651-3p、miR-651-3p与SP2 3’UTR及miR-876-5p与BPTF 3’UTR之间的靶向结合作用和结合位点。应用Ch IP实验验证ZHX2与linc00707的启动子区及SP2与MMP2、MMP9和VE-cadherin的启动子区之间的结合作用。应用裸鼠皮下移植瘤实验检测HNRNPD、ZHX2和linc00707对裸鼠移植瘤生长及裸鼠生存时间的影响,应用免疫组化染色检测裸鼠移植瘤的VM形成能力。结果:本研究发现HNRNPD、linc00707在胶质瘤组织和细胞中高表达,ZHX2、miR-651-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达,敲减HNRNPD、linc00707和过表达ZHX2、miR-651-3p均能显著抑制胶质瘤细胞的VM形成能力。敲减HNRNPD增加ZHX2 mRNA的稳定性,ZHX2与linc00707的启动子区结合负性调控其表达,linc00707能够靶向结合miR-651-3p,miR-651-3p与SP2 mRNA的3’UTR结合负性调控其表达,转录因子SP2分别与VM形成相关蛋白MMP2、MMP9、VE-cadherin的启动子区直接结合,发挥转录促进作用,联合应用HNRNPD、linc00707敲减和ZHX2过表达能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长并显著延长裸鼠生存期。本研究同时发现,miR-876-5p在胶质瘤细胞中低表达,能够通过靶向结合并负性调控BPTF,抑制胶质瘤细胞的VM形成能力。结论:1.HNRNPD、linc00707在胶质瘤组织和细胞中高表达,ZHX2、miR-651-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达。2.HNRNPD通过降低ZHX2 mRNA的稳定性调控胶质瘤细胞的VM形成能力。3.ZHX2通过与linc00707的启动子区结合抑制其转录,进而抑制胶质瘤细胞的VM形成能力。4.Linc00707靶向结合miR-651-3p,抑制miR-651-3p对SP2的负性调控作用,进而调控胶质瘤细胞的VM形成能力。5.转录因子SP2能够与VM形成相关蛋白MMP2、MMP9、VE-cadherin的启动子区直接结合,发挥转录促进作用。6.miR-876-5p在胶质瘤细胞中低表达,BPTF在胶质瘤细胞中高表达。miR-876-5p靶向结合并负性调控BPTF的表达,抑制胶质瘤细胞的VM形成能力。
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