神经病理性疼痛,如带状疱疹后神经痛和三叉神经痛,作为一类慢性疾病,疼痛持续时间长,难以根治,不仅对患者的生理及心理造成严重困扰而且给患者家庭带来巨大的经济负担。痛觉超敏,是神经病理性痛的一种典型症状,又称作“触诱发痛”,是指由非疼痛刺激诱发的疼痛感觉,该疼痛可由穿衣洗漱等日常活动诱发,成为慢性痛患者的最大困扰。因此,了解痛觉超敏的发生机制,特异性阻断其信息传导的神经环路,抑制其发生,具有重要的临床意义。脊髓背角作为痛觉传导通路中具有整合和敏化作用的重要初级中枢[1],其内中间神经元与投射神经元之间的突触联系是触觉及痛觉传导的重要环路基础,突触可塑性的变化进而使环路性质发生的变化在慢性痛形成过程中占有重要地位[2]。发生在脊髓背角触觉与痛觉信息的相互影响机制一直是研究热点。PKCγ~+神经元仅存在于中枢神经系统,是脊髓背角浅层的一类重要的中间神经元,主要分布在Ⅱ_i层,而Ⅱ_i层主要接受非伤害性信息的传入。Basbaum实验室1997年发表于science上的一篇文章首次提出PKCγ~+神经元与机械性痛觉超敏相关[3],近年来更有系列研究探讨PKCγ~+神经元参与炎性痛及神经病理性痛痛觉超敏的形成机制[4,5,6,7],但均未揭示具体的神经环路。本课题组2013年发表的文章中指出PKCγ~+中间神经元是“痛觉超敏闸门”的关键组成要素,闸门的开放是实现触觉信息在病理状态下经由痛觉通路上传的重要机制[8],但是对于PKCγ~+神经元的基本特性及闸门开放的条件并不明确。本研究将以构建的PKCγ-td tomato荧光标记鼠为研究平台,深入研究PKCγ~+神经元在中枢神经系统中的分布位置,基本电生理及形态学特性及其所接受的传入神经纤维类型并与PKCγ~-神经元作比较,深入探讨PKCγ~+神经元在“痛觉超敏闸门”中的作用[9];进一步研究大麻素作为促使该闸门开启介质的作用方式,为阐明痛觉超敏闸门的神经环路基础以及进一步寻找阻断触觉向痛觉转换通路的药物靶点提供依据。第一部分Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记鼠的制作与验证目的:制作Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记鼠,通过验证PKCγ与Tdtomato荧光蛋白共表达情况及PKCγ在中枢神经系统中的分布确定荧光标记鼠是否制作成功。方法:应用Crispar-cas 9技术制作P2A引导的tdtomato基因敲入鼠;取小鼠尾部组织,提取DNA,利用PCR及southern blot技术鉴定基因型;取小鼠脊髓及脑组织的冰冻切片,利用免疫荧光技术进行PKCγ和tdtomato的荧光双标,通过对单标及双标神经元的数量统计验证标记效率;利用原位杂交技术获得PKCγ与GluR,GAD及GlyT2的共标率,确定脊髓背角PKCγ~+神经元的基本属性;取脑与脊髓的连续冰冻贴片直接进行荧光拍片,对照小鼠第四版图谱确定PKCγ~+神经元在中枢神经系统中的分布。结果:Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记鼠制作成功,所插入基因序列稳定表达,tdtomato对PKCγ的标记效率达95%以上;PKCγ与GluR的共标率高达87%以上,与GAD及GlyT2仅有极少共标,表明PKCγ~+神经元主要是一类兴奋性神经元;PKCγ~+神经元在中枢神经系统中呈现广泛分布,主要位于海马CA1、CA2及CA3区,杏仁核、梨状皮层,小脑叶及小脑核,脊髓背角Ⅱi层等中枢神经系统功能区。讨论:Prkcg-P2A-Tdtomato荧光工具鼠的制作成功实现了PKCγ~+神经元的高效标记,极大的提高了膜片钳记录的效率和准确性;PKCγ~+神经元多为兴奋性中间神经元,极大可能承担信息传递或信息级联放大的任务。PKCγ~+神经元在在海马、杏仁核、脊髓背角Ⅱi层的集中分布表明与学习记忆、情绪调节、感觉传入的潜在联系,可为后续神经功能的研究提供参考。第二部分利用荧光标记鼠研究脊髓PKCγ~+神经元的基本特征,为进一步研究痛觉超敏发生机制提供结构基础目的:利用Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记鼠,通过刺激后根诱发突触后神经元电活动,判断PKCγ~+及PKCγ~-神经元所接受的传入神经纤维类型、基本电生理及形态学特征,为研究PKCγ~+神经元在痛觉超敏中的作用提供结构基础。方法:选取出生3-5周PKCγ-tdtomato荧光标记小鼠,首先制备足够长的脊髓后根进行复合动作电位记录,以确定不同类型神经纤维刺激阈值;制备保留后根的脊髓矢状切片,利用膜片钳技术,对脊髓后角的PKCγ~+及PKCγ~-神经元进行全细胞记录,记录神经元主动及被动膜特性,诱发性兴奋性突触后电位(eEPSPs)及诱发性抑制性突触后电位(eIPSPs),利用所测定的不同类型神经纤维刺激阈值范围确定神经元所接受纤维传入类型;依次灌流GABA及Gly受体拮抗剂bicuculline及strychinine判断PKCγ~+神经元接受的抑制性成分;记录完成后通过向细胞内注入biocytin,进行后期染色,记录神经元形态。结果:(1)PKCγ~+神经元与PKCγ~-神经元均表现为多种放电模式,其中PKCγ~+神经元以phasic及irregular的放电模式为主;PKCγ~-神经元以tonic及delay的放电模式为主。但PKCγ~+神经元基强度,阈值及静息电位绝对值较PKCγ~-神经元高。(2)Aβ纤维诱发的EPSP的刺激强度阈值为0.1-0.3V,传递速度为3.33-4.54 m/s;Aδ纤维诱发的EPSP的刺激强度阈值为0.4-1 V,传递速度为1.43-1.79 m/s;C纤维诱发的EPSC的刺激强度阈值为1.4-6V,传递速度为0.49-0.98 m/s。(3)PKCγ~+神经元主要接受Aβ纤维介导的兴奋抑制双重信息传入,少数神经元接受Aδ及C纤维信息的传入;PKCγ~-神经元主要接受Aδ及C纤维介导的兴奋性信息传入。(4)两类神经元均存在四种形态类型(中央型、岛型、辐射型、垂直型),其中PKCγ~+神经元以中央型为主。讨论:脊髓PKCγ~+神经元的放电模式和形态与PKCγ~-神经元存在诸多共同点,仅根据放电模式与形态特征难以判断神经元类别。两类神经元的主要区别在于初级传入神经纤维类型,PKCγ~+神经元主要接受Aβ纤维介导的低阈值非伤害性信息的传入,但在正常状态下受抑制性中间神经元的前馈抑制调控,不易被兴奋,因此构成了“痛觉超敏闸门”的基础回路结构。第三部分脊髓PKCγ~+神经元参与痛觉超敏形成的机制目的:探究内源性大麻素介导的脊髓PKCγ~+神经元兴奋性的改变是参与痛觉超敏形成的机制之一方法:选取出生后3周的PKCγ-tdtomato荧光标记小鼠,CCI造模成功后取材记录PKCγ~+神经元的静息膜电位,基强度,动作电位阈值,及由Aβ诱导的eIPSPs幅度等电生理特性的改变,与正常小鼠作对比,比较其改变以了解慢性痛形成后小鼠PKCγ~+神经元兴奋性的变化;鞘内单次给予2-AG注射后取材同样记录以上数据,并与正常小鼠作比较观察PKCγ~+神经元兴奋性的改变;选取出生3-5周正常的PKCγ-tdtomato荧光标记小鼠,记录浴液灌流内源性大麻素AEA及CB1受体拮抗剂AM251对PKCγ~+神经元eIPSPs的影响;通过低频电刺激(LFS)诱导eIPSPs的长时程抑制(LTD),并观察预灌流CB1受体拮抗剂NESS0327对LTD的影响,评价大麻素对PKCγ~+神经元eIPSPs的短时程及长时程变化的影响;选取出生3-5周正常的GlyT2-CB1-KO小鼠,记录给予内源性大麻素AEA灌流对PKCγ~+神经元eIPSPs的影响;通过低频电刺激诱导eIPSPs发生LTD,评价甘氨酸能神经元上CB1受体敲除对PKCγ~+神经元eIPSPs的短时程及长时程变化的影响;结果:(1)与正常小鼠相比,神经病理性痛形成后,PKCγ~+神经元爆发动作电位的比例升高;eIPSPs幅值下降;PKCγ~+神经元的基强度,阈值及静息电位绝对值降低;表明神经病理性痛形成后PKCγ~+神经元的兴奋性增强。(2)与正常小鼠相比,在体鞘内注射内源性大麻素2-AG后可使PKCγ~+神经元爆发动作电位的比例升高;基强度,阈值,静息电位绝对值及eIPSPs幅值降低;表明在体鞘内注射大麻素使PKCγ~+神经元的兴奋性增强,与CCI造模后的结果相似。(3)离体脊髓片灌流内源性大麻素AEA可降低PKCγ~+神经元由Aβ介导的eIPSPs幅值,该变化可类比于神经病理性痛形成后PKCγ~+神经元发生的变化;该过程可被CB1受体拮抗剂AM251逆转,而敲除甘氨酸神经元上的CB1受体也可以部分拮抗该效应,表明内源性大麻素及CB1受体的激活或可参与神经病理性痛的发生。(4)LFS可致Aβ诱导的PKCγ~+神经元eIPSPs发生LTD,该效应可被CB1受体拮抗剂NESS0327阻断;敲除甘氨酸神经元上的CB1受体可以阻止LTD的发生,表明内源性大麻素可通过激活甘氨酸神经元上的CB1受体参与eIPSPs的LTD的发生。讨论:CCI模型诱导神经病理性痛形成后及在体鞘内给予2-AG后,脊髓背角的PKCγ~+神经元兴奋性均增强;药理性抑制或敲除CB1受体都可以拮抗内源性大麻素对于eIPSPs的抑制效应,表明内源性大麻素参与PKCγ~+神经元相关的神经病理性痛的发生,三者之间存在紧密联系,为进一步研究痛觉超敏闸门的开启机制提供了重要的结构与功能基础。小结:1.成功构建Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记小鼠,高效标记脊髓PKCγ~+神经元,为PKCγ~+神经元参与痛觉超敏的脊髓神经机制研究提供了强有力的工具。2.利用Prkcg-P2A-Tdtomato荧光标记鼠发现脊髓PKCγ~+神经元与PKCγ~-神经元相比,兴奋性较低,主要接受低阈值信息的传入,正常生理状态下不易爆发动作电位,构成了“痛觉超敏闸门”的回路结构基础。3.在CCI诱导神经病理性痛或鞘内给予内源性大麻素后,PKCγ~+神经元的兴奋性增强,表明PKCγ~+神经元在机械性痛觉超敏闸门的形成过程中发挥重要的闸门作用;内源性大麻素可通过降低PKCγ~+神经元由Aβ诱导的eIPSPs幅值,参与形成LFS诱导的LTD,增强神经元兴奋性,为进一步阐明神经病理性痛的发生与维持机制提供了重要的功能基础。