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与长链脂肪酸相比,中链脂肪酸具有消化吸收快、减少脂肪沉积、调节能量代谢等特性,在食品、营养、和运动饮料等领域有着重要的应用价值。目前中链脂肪酸主要来源于椰子油和棕榈仁油,棕榈和椰子均是热带树木,在我国难以广泛栽培。植物提取法生产中链脂肪酸受季节性因素影响较大且纯化成本较高,因此发展绿色、高效、低成本的微生物法生产中链脂肪酸受到越来越多的关注。本文以大肠杆菌异源合成中链脂肪酸为研究对象,在初步构建逆向脂肪酸β-氧化途径的基础上,运用CRISPR-Cas9等技术分析代谢网络中影响合成途径效率的限制因素,建立乙酰辅酶A和辅因子NADH供给的协同调控机制,实现中链脂肪酸在大肠杆菌中的高效异源合成。本文研究结果有助于深入了解大肠杆菌的特异链长脂肪酸调控机制,为微生物高效合成各类链长脂肪酸及其衍生物提供重要的理论参考。本文主要研究内容如下:1.逆向脂肪酸β-氧化途径的初步构建为了构建最优的非天然逆向脂肪酸β-氧化途径,通过文献查阅、数据库比对、密码子优化等方式筛选最优的合成途径基因。选择来自于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的BktB来作为第一步反应中的硫解酶;选择大肠杆菌自身的FadB来进行途径的第二步反应的3-羟酰基辅酶A脱氢酶和第三步反应的3-羟酰基辅酶A脱水酶;选择来自于薄肌眼虫(Euglena gracilis)的Ter进行途径的第四步反应的反式烯酰辅酶A还原酶;选择大肠杆菌自身的硫酯酶YdiI作为途径的终止反应。成功构建逆向脂肪酸β-氧化途径,得到一株能表达中链脂肪酸的基因工程菌,实现中链脂肪酸从廉价底物葡萄糖的直接合成。2.乙酰辅酶A合成途径的构建在初步构建脂肪酸合成途径的基础上,我们利用CRISPR-Cas9技术敲除改造大肠杆菌基因组上乙酰辅酶A代谢流相关基因,分别抑制乙酰辅酶A代谢流向乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇等途径;过量表达不同来源由acs执行的乙酰辅酶A合成途径,回收利用有毒副产物乙酸的同时提高了胞内乙酰辅酶A含量,中链脂肪酸的产量提高至1.25g/L。通过乙酰辅酶A合成途径的构建,减少副产物乙酸大量积累对菌体生长代谢的不良影响;提高逆向脂肪酸β-氧化途径合成效率。3.途径限制性辅因子鉴定及其与乙酰辅酶A的协同调控对胞内乙酰辅酶A含量的优化没有带来中链脂肪酸产量的持续提高,途径合成效率受到了胞内氧化还原水平的限制。在提高乙酰辅酶A表达量的基础上我们协同调控还原性辅因子NADH表达量来实现发酵体系的氧化还原平衡,解除了胞内氧化还原水平对途径合成效率的限制;并且在增加体系内NADH的表达量后,来自肠沙门氏菌的抗反馈抑制突变体SE acsL41P执行的高效乙酰辅酶A合成途径使得逆向脂肪酸β-氧化途径在其最大合成效率下发挥作用。通过协同调控乙酰辅酶A和还原性辅因子NADH合成途径,目标产物中链脂肪酸的产量提高至4.2g/L。根据结果鉴定氧化还原辅因子NADH和乙酰辅酶A是逆向脂肪酸β-氧化途径的关键限制性因素。4.脂肪酸胞外转运系统的构建与鉴定为了减少产物积累造成的细胞毒性和反馈抑制,我们选择了细胞膜转运蛋白泵加快脂肪酸胞外方向的转运效率。从大肠杆菌基因组中克隆获得17种不同的转运蛋白基因,过量表达转运蛋白基因强化脂肪酸胞外分泌途径,根据脂肪酸胞外分泌程度筛选并鉴定得到2种转入蛋白基因marA和soxS及3种转出蛋白基因acrE、mdtC、mdtE。转入蛋白的鉴定,为大规模工业化生产以中链脂肪酸为前体物质的中链油脂类衍生物提供参考依据。脂肪酸胞外转运系统的构建有效降低了由于胞内产物过度积累所带来的细胞毒性,提高产物中链脂肪酸胞外回收率,降低产物提取成本,为微生物法发酵合成脂肪酸产业化奠定基础。