生物体本身处于外在的力学环境中,而生物体内部也保持着一种静态或动态的力学相互作用。研究表明,外在物理力和内部应力对于细胞生长、形态维持和分化起到了重要的作用。其中细胞骨架介导的机械转导是近年来的研究热点。然而,上述研究多集中于机械因素对正常细胞的作用及其机理研究,病理条件下,特别是缺血缺氧条件下机械刺激的细胞效应及机制研究尚未见报道。正常情况下,心脏内血流使心肌充盈,心腔扩张,对心肌产生一定的牵张刺激。严重烧伤早期由于缺血缺氧与炎症反应失控即发生了器质性心肌损害。此时血容量的减少以及过多过快补液所造成的血容量迅速增加等血液动力学的急剧变化使心肌细胞所受到的牵张刺激发生变化。牵张刺激的变化对于业已存在的心肌损害有何影响尚不清楚。显然,研究这种病理条件下心肌损害的发生机理更具有直接意义。临床研究表明,烧伤补液后血液中心肌酶含量较补液前显著上升,表明补液后心肌损害进一步加重,其机制却不甚明了。同时,由于目前对于防治“休克心”缺乏有效的治疗手段都促使我们进一步研究其发病机理并寻找新的干预手段。由于细胞骨架在信号转导、特别是机械转导中的重要作用,我们推测其可能在“休克心”的发生发展中起到了重要作用。为了验证上述设想,我们设计了如下实验:一、研究目的:明确机械牵张加重缺血缺氧对离体培养的心肌细胞的损伤效应,探讨细胞骨架(微丝、微管)在其中的作用及机制。二、材料方法:1. 采用离体培养的大鼠心肌细胞,建立机械牵张模型,从细胞形态、培养液中LDH含量及心肌细胞PI染色阳性率等几个方面明确机械牵张对心肌细胞的影响。2. 利用模型进一步施加缺血缺氧因素,分别检测10%牵张、缺血缺氧、10%牵张+缺血缺氧三组细胞在1、3、6、12h不同时相点细胞形态(免疫荧光)、培养液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色阳性率的变化。 <WP=10>3.分别检测10%牵张、缺血缺氧、10%牵张+缺血缺氧三组细胞在不同时相点微管、微丝蛋白含量(Western Blotting)及形态的变化(激光共聚焦显微镜)。4. 检测细胞骨架稳定剂taxol或(和)phalloidin对10%牵张+缺血缺氧组心肌细胞形态民、培养液LDH含量、TNF-αmRNA(RT-PCR)、MHCmRNA(RT-PCR)、PI染色阳性率的影响。三、主要结果:1. 通过比较、设计、调整,成功建立了心肌细胞体外牵张刺激模型。该模型具有制作方便、操作简单、易于观察的优点。大鼠心肌细胞在硅酮膜上生长状态良好。培养液中LDH含量及心肌细胞PI染色与正常对照组无明显差别。心肌细胞的进一步铺展及伪足的大量出现。。2. 与正常对照、10%牵张组和缺血缺氧组比较,10%牵张+缺血缺氧组心肌细胞有以下明显不同:LDH升高异常明显,呈现爆发性升高特点,各个时相点均显著高于正常组 (P<0.01) ,且与其它各组比较均明显增高 (P<0.01) ;TNF-αmRNA表达上升明显,增幅高于缺血缺氧组;β-MHC mRNA于表达峰提前,3h即达高峰,其后迅速降低,12h时与缺血缺氧组相比有明显下降;PI染色阳性心肌细胞比例明显增加。3. 正常非肌节型微丝在细胞内呈现相互交错网络状分布,受到机械牵张后表现为蛋白含量增加及发生与受力方向相关的重排;缺血缺氧后出现破坏,随时间延长破坏加剧;10%牵张+缺血缺氧刺激后细胞骨架破坏明显加速,表现在蛋白含量急剧下降及形态破坏加剧。微管呈现类似变化趋势,但其变化更加剧烈。4. 以微丝稳定剂taxol或(和)微管稳定剂phalloidin对10%牵张+缺血缺氧组心肌细胞进行干预后,各组细胞培养液中LDH含量、PI染色阳性率明显下降,MHCmRNAα型相对表达量下降减慢及β型波动减小。稳定微管后TNF-αmRNA上升趋势明显减弱。四、讨论:1. 设计了一种简单、经济、易行的单轴静态机械细胞牵张装置,实现了对缺血缺氧这一病理生理条件下心肌细胞的机械牵张。利用所建立的模型证实了10%的机械刺激强度在心肌细胞正常的生理范围之内,对于细胞无急性损伤效应。10%牵张12h后细胞的进一步铺展、伪足增多进一步提示了细胞功能活跃,结合其它文献一致说明了适度的机械刺激是一种正性刺激。2. 通过与正常组、10%牵张组和缺血缺氧组的比较,可以看出机械牵张+缺血缺氧组心肌细胞损伤最为严重。表现在:形态破坏的加剧,加重缺血缺氧对心肌细胞膜<WP=11>的损伤,加剧缺血缺氧对心肌细胞炎症相关基因的上调以及加剧缺血缺氧对心肌细胞收缩蛋白基因表达的负性调节。这就提示机械牵张加重了缺血缺氧对心肌细胞的损伤效应。3. 10%牵张能够显著增强缺血缺氧对心肌细胞微管、微丝的破坏作用,表现在微丝的断裂及蛋白含量的减少。可能与随着缺血缺氧造成能量溃乏时间的延长,细胞骨架对机械刺激的耐受减弱,造成此时机械牵张对骨架的破坏加剧有关。同时,这也进一步证实了机械牵张加重缺血缺氧心肌细胞损伤的效应。4. 微丝稳定剂taxol或(和)微管稳定剂phalloidin对10%牵张+缺血缺氧组心肌细胞进行干预后,该组心肌细胞损伤程度明显减轻,说明稳定细胞骨架能够有效的减弱10%牵张对缺血缺氧心肌细胞的损伤效应。上述效应可能与较好的维持细胞形态、减轻细胞内钙超载、抑制NF-ΚB的活化等有关。5.该模型较好的模拟了严重烧伤后体内出现的心肌细胞