【摘 要】
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生长激素受体(GHR)是一个单次跨膜蛋白,属于Ⅰ型细胞因子超家族,通过与生长激素(GH)结合而发挥其生物学功能;类胰岛素生长因子1(IGF-1)能显著改变正常人机体成分的分布,如脂肪减少、肌肉比重增高、体重增加等,主要以分泌方式作用于肌肉、骨骼等靶器官上的受体,进而调节动物生长发育。本试验以从江香猪为研究对象,运用分子克隆技术、序列比对分析、组织特异性表达检测、原代细胞培养、基因过表达和mRNA干
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生长激素受体(GHR)是一个单次跨膜蛋白,属于Ⅰ型细胞因子超家族,通过与生长激素(GH)结合而发挥其生物学功能;类胰岛素生长因子1(IGF-1)能显著改变正常人机体成分的分布,如脂肪减少、肌肉比重增高、体重增加等,主要以分泌方式作用于肌肉、骨骼等靶器官上的受体,进而调节动物生长发育。本试验以从江香猪为研究对象,运用分子克隆技术、序列比对分析、组织特异性表达检测、原代细胞培养、基因过表达和mRNA干扰等方法,从分子和细胞水平进一步阐述了GHR和IGF-1基因对从江香猪成肌细胞增殖的影响。主要研究结果如下:(1)本试验利用同源重组的方法成功克隆了从江香猪IGF-1、GHR基因编码区序列,生物信息学分析得知,IGF-1基因全长片段为393 bp,共编码131个氨基酸,蛋白结构分析发现,从江香猪IGF-1为亲水性碱性蛋白质,属于分泌型蛋白,与NCBI中野猪的登录序列比对后得知,从江香猪存在一个G213A突变位点,为同义突变。GHR基因全长为1 917 bp,共编码639个氨基酸,存在一个A1446G同义突变位点,其蛋白为含有一个跨膜结构的亲水性酸性蛋白质,属于不稳定蛋白;IGF-1、GHR基因的核酸序列同源性均与野猪最高,所编码的蛋白定位不同,推测两者发挥生物学功能的场所不同。(2)采用qRT-PCR的方法检测从江香猪和大白猪不同组织间IGF-1和GHR基因mRNA的表达量差异,发现IGF-1 mRNA的表达量在从江香猪小肠、大肠、肺脏和背最长肌中的表达量最高,在不同组织比较中除背最长肌差异不显著外其他组织均显著低于大白猪(P<0.05);GHR基因mRNA在从江香猪不同组织中的表达量分别为:脾脏>肝脏>肺脏>心脏>脂肪>肾脏>背最长肌>大肠>小肠,其中背最长肌、肾脏、大肠、小肠组织的表达量极显著低于大白猪(P<0.01)。(3)试验运用Ⅱ型胶原酶配合中性蛋白酶消化法、细胞差数贴壁的原理提取从江香猪原代成肌细胞,构建针对GHR基因的过表达载体p EGFP-C1-GHR和sh RNA干扰载体p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-GHR以及一条阴性对照p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-NC;针对IGF-1基因设计并构建过表达载体p EGFP-C1-IGF-1和sh RNA干扰载体p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-IGF-1和一对阴性对照p GPH1/RFP/Neo-sh RNA-NC,经验证其正确性后,分别转染成从江香猪成肌细胞,在细胞水平验证其表达及细胞增殖的影响。结果显示,过表达GHR基因后,能显著提高IGF-1基因的表达,同时导致TAZ、YAP基因mRNA表达量显著降低且能促进成肌细胞的增殖;当干扰GHR基因的表达后,IGF-1、TAZ、YAP基因的表达量均极显著降低。过表达IGF-1基因后,IGF-1、TAZ、YAP基因mRNA的表达量均受到了抑制,干扰IGF-1基因表达后,对GHR和TAZ基因的抑制作用解除、但抑制了YAP基因的表达,分别对成肌细胞的增殖起到了促进和抑制的作用。本研究阐述了GHR和IGF-1基因对从江香猪成肌细胞增殖的促进作用。
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