研究背景和目的结直肠癌作为常见的消化道肿瘤,其发病率呈逐年上升且年轻化趋势。根据2020年全球癌症统计数据显示,结直肠癌在所有癌症发病率中排在第三位,所有癌症死亡率中排在第二位,严重危害人类健康。且约20%～40%患者在结直肠癌确诊时已合并远处转移,转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因,因此探究结直肠癌转移相关的分子机制,寻找新的结直肠癌转移分子标记物,是当前肿瘤研究的热点内容。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是指肿瘤细胞在生长过程中,由肿瘤细胞及细胞外间质相互作用后形成的肿瘤细胞生长的特殊环境。TME是肿瘤细胞赖以生存的场所,肿瘤细胞、间质细胞及它们释放的各种细胞因子与细胞外基质共同组成调控肿瘤血管生成的网络,其中血管内皮细胞的激活是肿瘤血管生成的关键,因为血管生成有赖于内皮细胞的激活、迁移并最终形成血管腔。血管新生开关被激活,新血管不断地生成,不仅为肿瘤生长提供营养物质,还为肿瘤转移奠定了基础。TME中新生血管生成是肿瘤细胞增殖、侵袭周围组织,尤其是发生远处转移的重要基础。形成素同源蛋白2（formin-like 2,FMNL2）基因是形成素蛋白（Formins）家族成员之一,是一种重要的肌动蛋白成核因子,能促进肌动蛋白的聚合。根据文献报道:FMNL2在多种癌症如结直肠癌、黑色素瘤中表达失调,并参与癌细胞的侵袭行为和进展。但其潜在的相互作用蛋白及作用机制尚不清楚。在前期工作中,我们发现FMNL2在高转移结直肠癌细胞株及组织中表达上调。通过酵母双杂交技术,筛选出与FMNL2结合特异性较强的EGFL6作为后续研究对象。表皮生长因子样结构域-6（epidermal growth factor-like-domain 6,EGFL6）是一种新的类表皮因子域超家族成员,EGFL6是一种分泌蛋白,文献检索结果提示其可能参与血管微环境的调控。具有EGF结构域和MAM结构域,又称为MAEG。EGFL6在微环境中有两种存在形式:膜结合蛋白和胞外基质蛋白。EGFL6包含1个N端信号肽、4个半EGF重复序列、1个整合素结合序列和1个C端MAM结构域,MAM结构域在许多功能多样蛋白的胞外区存在,且具有细胞粘附的潜能。Wang X等研究发现,与正常组织相比,EGFL6不但在乳腺癌、肺癌、脑膜瘤、黑色素瘤和卵巢癌中高表达,同时在肺癌、脑膜瘤和卵巢癌间质的内皮细胞中也高表达。Western blot检测结果还显示,EGFL6作用人脐静脉血管内皮细胞后能够激活ERK1/2信号通路。ERK1/2信号通路是众多组织中调控细胞增殖、凋亡和分化的重要通路。ERK1/2信号通路可促进人脐静脉血管内皮细胞增殖和新血管生成。新血管生成后可为肿瘤提供更多的营养物质,加速肿瘤的生长,促进癌细胞的转移。本实验目的在于明确FMNL2与EGFL6之间相互作用及调控关系、EGFL6与CKAP4的相互作用。阐明FMNL2/EGFL6/CKAP4在结直肠癌血管生成和转移中的作用及机制。为肿瘤转移的临床诊治、预后及药物筛选提供新的基因靶点。研究方法1.通过免疫印迹法western blot和实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）技术检测NCM460细胞株及结直肠癌细胞株中FMNL2的表达情况。构建过表达及干扰FMNL2稳定细胞株,通过Transwell实验、鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验、裸鼠皮下瘤模型、尾静脉肺转移模型、盲肠原位种植肝转移模型等体内体外实验验证FMNL2促血管生成及转移的作用。2.通过免疫荧光、免疫共沉淀Co-IP、GST pull down实验验证FMNL2与EGFL6的相互作用关系。3.通过免疫印迹法western blot和RT-q PCR技术检测NCM460细胞株及结直肠癌细胞株中EGFL6的表达情况。通过酶联免疫吸附实验ELISA及western blot检测过表达FMNL2后结直肠癌细胞上清中EGFL6的表达情况。通过透射电镜观察细胞外囊泡形态,提取细胞外囊泡并使用其通用标志物进行鉴定。免疫荧光对结直肠癌细胞株中细胞外囊泡进行定位。构建过表达及干扰EGFL6稳定细胞株,通过鸡胚尿囊膜实验,Transwell实验、小管形成实验、裸鼠皮下瘤模型、尾静脉肺转移模型、盲肠原位种植肝转移模型等体内体外实验验证FMNL2通过EGFL6旁分泌调控结直肠癌的血管形成及转移的作用。Western blot检测结直肠癌配对组织中FMNL2、EGFL6、CD31的表达情况及相关性。免疫组化检测正常肠粘膜上皮组织及不同结直肠癌组织中FMNL2、EGFL6、CD31的表达情况。4.免疫荧光、免疫共沉淀Co-IP实验验证EGFL6与CKAP4的相互作用关系。免疫印迹法western blot检测信号通路。研究结果1.Transwell实验、鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验结果显示:FMNL2能够促进人脐静脉血管内皮细胞的迁移以及血管生成,差异具有统计学意义（P<0.05）。裸鼠皮下瘤模型以及皮下瘤免疫组化结果显示:FMNL2能促进体内血管的生成,差异具有统计学意义（P<0.05）。尾静脉肺转移模型、盲肠原位种植肝转移模型等实验结果显示FMNL2能促进结直肠癌的肺、肝转移,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.免疫荧光、免疫共沉淀CO-IP结果显示:EGFL6能与FMNL2相互作用,GST-pull down结果显示:EGFL6能直接结合FMNL2-FH3（23—469AA）结构域。3.通过western blot、ELISA检测条件培养基中EGFL6的含量,结果显示:过表达FMNL2结直肠癌细胞上清中EGFL6的含量增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过透射电镜观察到细胞外囊泡呈圆形或者椭圆形。提取细胞外囊泡,使用其通用标志物进行鉴定,结果显示:细胞外囊泡可以作为EGFL6运送至胞外的运输途径。Transwell实验、鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验结果显示:FMNL2通过EGFL6旁分泌调控人脐静脉血管内皮细胞的迁移以及血管生成,差异具有统计学意义（P<0.05）。裸鼠皮下瘤模型以及皮下瘤免疫组化结果显示:FMNL2通过EGFL6促进体内血管的生成,差异具有统计学意义（P<0.05）。尾静脉肺转移模型、盲肠原位种植肝转移模型结果显示:FMNL2通过EGFL6促进结直肠癌肺、肝的转移,差异具有统计学意义（P<0.05）。结直肠癌配对组织western blot结果显示:FMNL2、EGFL6、CD31的表达有正相关性。免疫组化结果显示:与正常肠黏膜上皮组织相比,结直肠癌组织中FMNL2、EGFL6、CD31的表达明显增高,且在同一位置表达具有相关性。4.在人脐静脉血管内皮细胞中EGFL6能与细胞骨架膜蛋白CKAP4结合,FMNL2能通过EGFL6旁分泌作用于内皮细胞活化ERK信号通路,促进结直肠癌发生发展。结论1.FMNL2通过刺激肿瘤血管生成,促进结直肠癌的发生发展;2.FMNL2与EGFL6二者存在直接相互作用;3.FMNL2能通过EGFL6旁分泌作用于内皮细胞活化ERK信号通路,促进血管的生成,从而促进结直肠癌发生发展。