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1研究目的(1)通过研究AKT信号通路抑制剂AZD5363对Hep-G2和Huh-7细胞系的影响,观察肝癌细胞的细胞增殖及侵袭迁移能力的影响；(2)通过探究AZD5363对Hep-G2和Huh-7细胞系AKT信号通路蛋白表达水平的影响,观察AZD5363对肝癌细胞AKT信号通路的影响；(3)通过探究AZD5363对Hep-G2和Huh-7细胞系mTOR蛋白及SMG-1蛋白表达水平的影响,探究AZD5363作用于肝癌细胞的机制。2实验方法2.1细胞培养人肝癌细胞系Hep-G2、Huh-7均来自山东大学附属山东省立医院肝病中心。Hep-G2和Huh-7细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。所有的细胞均在37℃,5%C02的湿润的培养箱中培养。2.2细胞增殖能力测定细胞生长速率通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(Dojindo Corp)进行测定。将细胞接种在细胞密度为1000-2000厨L的96孑L板中培养过夜,每孔中含90 μ 1培养基,然后用不同浓度的AZD5363作用各种肝癌细胞系24h,48h和72h。而后根据说明书每个孔中加入10 μ 1的CCK-8试剂。根据每种细胞的实际情况在孵箱中培养1～3h后,通过测量450nnm处的吸光度来确定细胞活力。2.3细胞迁移能力测定细胞经胰蛋白酶消化处理后,加入无血清培养基(含0.1% BSA)制备细胞悬液,按细胞计数结果调整细胞密度,将Transwell小室放入24孔板中。上室加入含细胞的无血清的培养基200 u 1,下室加入750 μ 1含10%FBS的培养基,每组3个复孔,取出Transwell小、室,经PBS冲洗后用棉签擦去微孔膜上层的细胞,10%PBS甲醛固定l0min,甲醇浸泡l0min,而后1%吉姆萨染色30min。于显微镜下随机计数3个视野(×400)内的染色的细胞数,并以此评价肝癌细胞的迁移能力。2.4 Western blot分析将细胞接种于6孔板中,经药物处理后提取蛋白,添加RIPA和PMSF的混合物(RIPA:PMSF=100:1) ( Beyotime Biotechnology),样品蛋白浓度由BCA蛋白定量检测试剂盒(Thermo Scientific)测定,随后每个样品各取约50μg用于蛋白免疫印迹分析。蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,而后转移到NC膜。一抗在4℃下孵育过夜,二抗在室温下轻摇孵育2^后成像分析。除GAPDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司,所有一抗购自Cell Signaling公司,包括phosphor-mTOR (ser2448) (D9C2) (#5536S), phosphor-Akt (Thr450) D5G4 (#12178), phosphor-GSK-3β (ser9) (5B3) Rabbit mAb (#9323), mTOR (7C10) (#2983S), AKT (#9272), GSK-3(3 (27C10) Rabbit mAb (#9315), SMG-1 (Q25) Rabbit mAb (#4993s),此外,二抗也均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2.5数据分析和统计统计分析采用SPSS统计软件(18.0版)和GraphPad Prism 5.0软件。所有数据均表示为x+s,各个组之间的差别应用t检验,以P<0.05为有统计学意义。3结果3.1体外实验中AZD5363抑制肝癌细胞系的增殖呈时间和剂量依赖性给予不同浓度的AZD5363后,Hep-G2和Huh-7的细胞生长能力均受到明显抑制,并且随药物浓度的升高,抑制率加大,两种细胞的抑制曲线相似。加药72h后,Hep-G2的IC50值约为18.476μmol/L,而Huh-7的IC50值约为17.80μmol/L,表明AZD5363能明显作用于两种细胞系,抑制细胞增殖,并且Huh 7细胞系对AZD5363更敏感。3.2 AZD5363抑制肝癌细胞的迁移能力AZD5363能明显抑制Hep-G2和Huh-7细胞系的迁移能力,并且随药物剂量的加大,其抑制率明显提高。3.3 AZD5363抑制AKT分子的磷酸化Western blot的结果显示,AZD5363作用于Hep-G2和Huh-7两种细胞系的AKT信号通路,能明显抑制AKT及GSK-3β分子的磷酸化,并呈明显的剂量依赖性,两种细胞系的结果相似。3.4 AZD5363能促进Huh-7细胞系mTOR分子的磷酸化Hep-G2和Huh-7同时暴露于AZD5363不同的时间后,Huh-7细胞系的磷酸化的mTOR分子表达增强,统计结果显示,Huh-7的AZD5363组的表达水平高于对照组,差别有统计学意义(P<0.01),而Hep-G2的表达水平差别无统计学意义。Hep-G2和Huh-7同时暴露于不同浓度的AZD5363后,同样仅Huh-7的磷酸化的mTOR水平的改变有统计学意义(P<0.01)。同时,从mTOR分子磷酸化水平的改变趋势可以看出,其改变呈现一定的时间和计量依赖性,即随作用时间延长和剂量加大,磷酸化的mTOR分子改变水平也增高。3.5 AZD5363能促进Huh-7细胞系SMG-1分子的表达Hep-G2和Huh-7同时暴露于AZD5363不同的时间后,Huh-7细胞系的SMG-1分子表达增强,统计结果显示,Huh-7的AZD5363组的表达水平高于对照组,差别有统计学意义(P<0.005),而Hep-G2的表达水平差别无统计学意义。Hep-G2和Huh-7同时暴露于不同浓度的AZD5363后,同样仅Huh-7的SMG-1分子表达水平的改变有统计学意义(P<0.01)。同时,从SMG-1分子表达水平的改变趋势可以看出,其呈现一定的时间和计量依赖性,即随作用时间延长和剂量加大,SMG-1分子改变水平也增高。4结论(1)AKT信号通路抑制剂AZD5363能明显抑制肝癌细胞细胞增殖能力及细胞侵袭迁移的能力,并呈时间和剂量依赖性。(2)AZD5363能明显抑制肝癌细胞AKT信号通路的表达水平,并呈时间和剂量依赖性。(3) AZD5363能明显抑制肝癌细胞的mTOR蛋白分子和SMG-1蛋白分子的表达水平并呈时间和剂量依赖性,但其作用因肝癌细胞系的不同而不同。1研究目的(1)观察高脂饮食对小鼠肝大部切除术后肝脏再生的影响。(2)探讨高脂饮食对小鼠肝脏再生组织中Wip1蛋白表达及NF-KB信号通路的影响。2实验方法2.1动物模型的建立及分组将48只8周龄雄性C57BL6小鼠随机分为两组：普通饮食组(n=24)和高脂饮食组(n=24)。所有小鼠均进行2／3肝大部切除术,术后给予相应地饮食,其中普通饮食组的饲料脂肪含量约为6.5%,高脂饮食组的饲料脂肪含量约为21%。而后分别于术后48h、72h、120h再次手术切除小鼠的肝脏并取血,每组每个时间点8只小鼠,每只小鼠的肝组织分两份,一份液氮冻存,一份福尔马林中保存。2.2 Western blot取液氮中的小鼠再生肝组织,提取蛋白,检测肝组织中增殖细胞核抗原(PCNA)、Wip1、cyclin D以及NF-KB信号通路的表达情况。2.3 RT-PCR取液氮中的小鼠再生肝组织,提取mRNA,检测PCNA和Wip1的mRNA水平。3结果3.1肝大部切除术后肝重的变化统计数据显示小鼠行2/3肝脏切除术后,和对照组相比,高脂饮食组的肝重/体重质量比在48h(3.05±0.20vs2.31±0.16)和72h(3.72±0.23vs3.02±0.19)明显升高(p<0.001)。 高脂饮食组的肝脏再生比率在48h(67.25±6.73vs51.50±4.78)和72h(78.98±4.77vs69。00±5.17)也相应升高(p<0.01)。3.2小鼠再生肝组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达Western blot检测结果显示高脂饮食组术后24h和120h的PCNA蛋白的表达量均明显高于对照组同一观察点的PCNA蛋白表达量(P<0.05),而术后72h的表达量差别无统计学意义,PCNA表达量的峰值在高脂饮食组出现在术后48h,而在对照组出现在术后72h。RT-PCR结果显示术后实验组在48h的印值变化明显高于相同时点对照组中的cp值变化(P<0.002),第五天则差别不显著。3.3小鼠再生肝组织p-NF-KB p65和cyclin D的表达：Western blot检测结果显示实验组术后48h,NF-KB及p-NF-KB的表达量明显高于对照组同一观察点的水平。实验组术后48h和72h的cyclin D的表达量也高于相应时间点对照组的表达量。3.4小鼠再生肝组织中Wip1的表达：Western blot检测结果显示实验组术后48h和120h wip1的表达量均明显低于对照组同一观察点的表达量(P<0.001)。RT-PCR结果显示术后实验组在48h的印值变化明显低于相同时点对照组中的cp值变化(P<0.05),其他时间点则差别不显著。4结论(1)高脂饮食能促进PCNA的表达,促进小鼠肝脏再生。(2)高脂饮食能促进Wipl的表达,促进NF-KB信号通路的激活及其下游分子cyclin D的表达。本文揭示了高脂饮食在小鼠肝脏再生中作用并对其机制进行初步探讨,具有重要的学术意义。