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结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率一直呈上升趋势,尤其在发展中国家。全球每年约增加120万结直肠癌新病例,60多万人死于该疾病。目前对于结直肠癌的临床治疗主要采用以手术为主、化疗和放疗为辅的综合治疗,但效果并不理想。以手术为主的结直肠癌治疗疗效有限说明肿瘤的生物学行为特点是影响患者生存的关键。本研究课题分析了抑癌基因缺氧诱导因子1a抑制因子(hypoxia inducible factor 1, alpha subunit inbitor, HIF1AN,也称factor inhibiting HIF-1, FIH-1)在结直肠癌中的作用,并鉴定了在结直肠癌中调控其表达的关键miRNA。在此基础上,研究这一调控关系对结直肠癌发生发展过程的影响。目的是从非编码RNA对肿瘤相关关键基因的调控角度来解释结直肠癌生物学行为的分子机制,为结直肠癌的早期诊断和分子干预建立理论基础。第一部分FIH-1在结直肠癌组织中的表达以及其临床意义目的：验证抑癌基因FIH-1在结直肠癌组织中的表达,并分析其临床意义。方法：采用免疫组织化学染色方法检测FIH-1在结直肠癌中的表达型,同时用定量PCR检测FIH-1在结直肠癌中的表达,并分析FIH-1的表达与结直肠癌发生以及侵袭转移的相关性。结果：免疫组织化学染色发现FIH-1在结直肠癌组织和正常肠粘膜组织中均有表达,而在结直肠癌组织的表达低于癌旁正常结直肠组织。对定量PCR技术检测结果分析发现FIH-1在结直肠癌组织中的低表达程度与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移和远处器官转移相关。结论：抑癌基因FIH-1在结直肠癌组织中表达低于癌旁正常组织,其低表达程度与结直肠癌的发生发展相关。第二部分结直肠癌miRNA-31/FIH-1调控关系的建立目的：分析鉴定调控抑癌基因FIH-1在大肠癌中表达的miRNA,研究FIH-1在结直肠癌中低表达的关键因素。方法：利用已有的数据库结合文献报道,分析调控FIH-1表达并且与结直肠癌相关的关键miRNA。通过定量PCR检测目标miRNA与FIH-1在结直肠癌中的表达,分析两者相关性。并通过细胞转染技术,在细胞水平鉴定目标miRNA对FIH-1的调控关系。在此基础上,通过荧光素酶报告基因实验,来明确miRNA-31对FIH-1基因的直接调控关系。并对目标miRNA在结直肠癌发生发展以及预后中的作用进行进一步分析。结果：在结直肠癌组织中,miRNA-31与FIH-1表达呈负性相关关系。在结直肠癌细胞系HCT116和SW1116中,通过干扰和过表达miRNA-31,均发现miRNA-31负性调控FIH-1的表达水平。荧光素酶报告基因实验证明miRNA-31直接作用于FIH-1的3’UTR,FIH-1是miRNA-31的下游靶基因。结直肠癌中miRNA-31的高表达是引起FIH-1表达下降的重要因素之一。MiRNA-31高表达的结直肠癌易侵袭转移,患者预后较差。结论：MiRNA-31与FIH-1表达呈负性相关关系,FIH-1是miRNA-31下游靶基因之一；结直肠癌中miRNA-31的高表达是引起FIH-1表达下调的一个重要因素；miRNA-31的表达水平与结直肠癌的发生发展和预后相关。第三部分MiRNA-31/FIH-1调控关系对人结直肠癌细胞功能的影响目的：研究miRNA-31/FIH-1调控关系对结直肠癌细胞功能的影响。方法：利用细胞转染技术,下调miRNA-31的表达。继而通过MTT实验检验miRNA-31/FIH-1调控关系对结直肠癌细胞HCT116和SW1116增殖的影响；通过Transwell实验检验miRNA-31/FIH-1调控关系对结直肠癌细胞HCT116和SW1116侵袭和转移能力的影响。结果：通过体外实验降低miRNA-31在结直肠癌细胞HCT116和SW1116中的表达可以提高FIH-1的表达水平。MTT结果表明下调miRNA-31表达(上调FIH-1表达)可以抑制结直肠癌细胞HCT116和SW1116的增殖能力；同样Transwell结果表明,下调miRNA-31表达(上调FIH-1表达)可以抑制结直肠癌细胞HCT116和SW1116的侵袭和转移能力。结论：通过体外细胞实验证实miRNA-31/FIH-1调控关系可以影响结直肠癌细胞的细胞功能,下调miRNA-31的表达可以抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力。第四部分MiRNA-31/FIH-1调控关系对裸鼠结直肠癌生长的影响目的：研究miRNA-31/FIH-1调控关系在体内对结直肠癌细胞异种移植瘤的影响。方法：通过慢病毒感染技术获得miRNA-31稳定下调的HCT116细胞,继而通过裸鼠皮下接种miRNA-31稳定下调的实验组HCT116细胞,以及接种对照组HCT116细胞,构建皮下移植瘤模型,观察瘤体体积及瘤重差异。利用免疫组织化学染色方法和Western blot方法检验FIH-1蛋白的表达,以验证皮下移植瘤中的miRNA-31/FIH-1调控关系。结果：体内裸鼠皮下成瘤模型中,miRNA-31低表达组裸鼠肿瘤体积较对照组裸鼠显著减小,肿瘤重量较对照组裸鼠显著降低。免疫组织化学染色和Western blot结果显示FIH-1蛋白在实验组裸鼠皮下移植瘤中表达增高。结论：通过体内裸鼠皮下移植瘤实验进一步证实miRNA-31/FIH-1调控关系不但可以影响肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,而且可以影响结直肠癌细胞的成瘤。