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血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染病,流行于我国的日本血吸虫病是由日本血吸虫(Schistosoma japonicum)侵入人体而致病,是我国目前面临的重要公共卫生问题之一。湖北钉螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸虫惟一的中间宿主,在日本血吸虫病传播过程中起着关键作用。在湖北钉螺的早期发育阶段,新陈代谢及对血吸虫毛蚴感染产生的免疫应答都会产生大量的不稳定的活性氧族物质(reactive oxygen species, ROS),包括氧化氢、羟自由基和超氧阴离子等。ROS具有很高的氧化活性,能够对蛋白、质膜和DNA造成直接的损伤,产生严重的生物学效应,当在机体内大量堆积时可导致细胞和组织的死亡。为了适应高度的氧化胁迫压力的环境及对寄生虫的免疫应答反应,宿主通过合成抗氧化酶,在宿主一寄生虫的接触面表达以适应及抵抗氧化胁迫的压力。抗氧化酶在保护宿主抵御来自寄生虫新陈代谢和白细胞激活的ROS的氧化损伤起重要作用。研究已发现湖北钉螺体内的抗氧化酶包括：谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase)、过氧化氢酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidases, TPx),这些抗氧化酶在钉螺体内发挥着重要的抗氧化作用。硫氧还蛋白过氧化物酶作为一种新发现具有显著抗氧化作用的酶,以硫氧还蛋白作为电子供体去除机体内的活性氧类物质,不仅具有强大的抗氧化功能,而且在细胞分化、凋亡和细胞增殖等方面都具有调节作用。目前已发现在多种寄生虫[22-36]及其宿主[37-40]中存在,其结构与功能各异,但湖北钉螺体内TPx的结构以及抗氧化功能的研究亦未见报道。由于TPx具有保护宿主抵御来自寄生虫新陈代谢和感染引发的ROS的氧化损伤能力,因此,对湖北钉螺TPx基因及其在湖北钉螺抗氧化中所起作用的研究,为湖北钉螺宿主与日本血吸虫相互关系和理解提供新思路及相应实验依据。研究首先,以湖北钉螺的RNA为模板,根据湖北钉螺转录组数据库(未发布)注释的硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)的基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增目的基因。获得的目的序列,参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit Mser Manμal设计3’端与5’端RACE引物：5’GSP1,3’GSP2。利用TRIzol试剂提取湖北钉螺总RNA, SMARTer Reverse Transcriptase反转录成第一链3’cDNA和5’cDNA,并分别以其为模板,UMP、5’GSP1, UMP、3’GSP2为引物进行PCR扩增5’末端与3’末端cDNA,将测序成功的5’末端与3’末端cDNA序列比对拼接出Oh TPx基因全长cDNA,通过NCBI网站提交注册全基因序列,并命名为TPx基因。将目的基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌BL21,对重组基因进行DNA测序,利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性、开放阅读框(ORF)进行比较分析正确后进行原核诱导表达,并经亲和层析法纯化重组蛋白(TPx)——TPx/His。结果显示：RACE扩增获得湖北钉螺全长TPx基因NCBI注册基因命名为TPx,登陆码：JN831437。TPx基因全长992bp,ORF为750bp,编码249个氨基酸,预测蛋白质相对分子量27000Da；表达并纯化出可溶性TPx蛋白,相对分子量约27000Da。由此,制备了可溶性重组蛋白TPx,为后续研究重组蛋白抗氧化活性,提供具有活性的蛋白质。将获得的纯化蛋白参照文献中的实验方法,在重组TPx蛋白不同浓度梯度下加入H202反应后,根据反应剩余的H202和KSCN、Fe(NH4)2(SO4)2形成的络合物的D480来判断重组TPx蛋白还原H202的能力。同样参照文献中的实验方法[19],进行重组TPx蛋白保护超螺旋DNA实验,通过在金属催化氧化系统(metal-catalyzed oxdation system, MCO)下,检测超螺旋状质粒DNA受到羟自由基破坏形成环状质粒DNA情况来完成的。结果显示：体外H202还原实验中,纯化重组蛋白具有利用DTT还原H202的能力。超螺旋DNA损伤保护实验中,在MCO体系存在下,重组蛋白具有保护超螺旋DNA免受氧化损伤的功能。提示湖北钉螺TPx蛋白具有利用DTT还原H202和保护超螺旋DNA的抗氧化功能。Real-time RT-PCR分析日本血吸虫毛蚴侵袭湖北钉螺TPx基因表达情况,方法参照文献[38],血吸虫毛蚴侵袭湖北钉螺实验设置,未暴露组：未加入新鲜孵化的毛蚴的F2代湖北钉螺50只；暴露组：取F2代湖北钉螺200只,放入24孔培养板中,每孔一只螺。每孔放入10只毛蚴,每孔加满脱氯水,28～30℃灯光照射下,暴露组分别于5hr、10hr、24hr、48hr四个时间点各取50只钉螺,经液氮处理后,冻存于-80℃备用。用TRIzol试剂提取各处理组钉螺总RNA,逆转录合成第一链cDNA,并以其为模板,使用目的基因TPx引物和内参基因18SrRNA引物进行PCR扩增；Real-time RT-PCR反应使用Applied Biosystens7000Real-time PCRSystem,反应体系参照DBI提供SYBR Green QRT-PCR Master mix说明书配制20μl体系,Real-time RT-PCR三步扩增法反应条件：Stage1:95℃2min, Stage2:95℃10s,56℃31s,72℃30s,共40循环,Stage3:60℃20min。实验结束时,根据扩增曲线设置荧光强度阈值,导出Ct值,保存融解曲线,根据文献中提供的公式：倍差值(Fold change)=2-ΔΔCt=2-[(CtTPx,exposed-Ct18S,exposed)-(CtTPx,μnexposed-Ct18S,nnexposed)]计算日本血吸虫毛蚴侵袭湖北钉螺不同时间点TPx基因表达的倍差值。结果表明：感染早期TPx基因表达上调,随后表达下调到与感染前水平相似。提示TPx蛋白参与湖北钉螺-日本血吸虫毛蚴感染过程的早期应激反应,为湖北钉螺宿主与日本血吸虫相互关系和理解提供新思路及相应实验依据。