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疏棉状嗜热丝孢菌耐热脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase)是重要的工业酶,具有良好的耐热性和脂肪酶特性,在油脂化学品加工业、食品加工业和生物表面活性剂等领域广泛应用。该酶的传统表达方法是通过疏棉状嗜热丝孢菌内分泌得到,由于产物量少、杂质多、纯化困难等原因,限制了其工业化应用。丝状真菌具有强大的胞外蛋白分泌能力广泛用于同源或异源蛋白的表达,是优良的蛋白表达宿主和重要的工业酶制剂生产菌株。黑曲霉(Aspergillus niger)具有较好的的安全性(Generally Recognized as Safe)、蛋白翻译后加工修饰功能和高效的蛋白表达和分泌系统,使得其成为理想的同源或外源蛋白表达宿主。本研究采取的基础菌株SH-2来源于高产糖化酶的CBS 513.88,具有不产孢子、菌丝粗短、发酵粘度小的特点。野生型无孢黑曲霉SH-2分泌表达的糖化酶总量达到20 g/L,这些蛋白的大量表达不利于目的蛋白产量的提高及目的蛋白下游分离纯化等,因此本研究通过利用双向筛选标记pyr G连续敲除黑曲霉菌株SH-2多拷贝糖化酶基因,提高目的蛋白的表达量,为该菌株成为高效表达同源或异源蛋白的菌株打下基础。同时通过密码子优化、使用强启动子、降低蛋白反馈抑制及构建不同的嗜热脂肪酶(Tll)表达载体,来提高Tll在改造过的黑曲霉SH-2中的表达量。将构建好的不同的Tll表达载体分别转化进入多拷贝糖化酶基因敲除菌株SH-2中,转化子发酵液单位酶活最高为150 U/m L,层析后耐热脂肪酶转化子蛋白量为0.83 g/L,较野生型SH-2中表达的耐热脂肪酶转化子层析后蛋白量(0.426g/L)高出一倍。为之后的发酵中试和提高蛋白表达量的研究奠定了基础。