论文部分内容阅读
目的:本研究旨在探讨microRNA-1225-5p(miR-1225-5p)在喉癌(LC)中的作用及机制。方法:通过qPCR分析收集的20例喉癌患者样本miR-1225-5p表达情况。使用miR-1225-mimic 和 miR-1225 inhibitor 对 Hep-2 细胞进行 miR-1225-5p 的过表达和干扰实验,并使用MTT法检测miR-1225-5p对于细胞增殖的影响,使用克隆增殖实验检测不同组克隆形成数,使用BrdU免疫荧光法检测细胞增殖活力,采用流式细胞仪(FC)检测miR-1225-5p在Hep-2细胞周期进展中的作用,Hoechst 33342染色实验和AnnexinV-FITC/PI FC 检测 miR-1225-5p 对于 Hep-2 细胞凋亡的影响,qPCR 及 western blot检测Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达水平变化,western blot检测Caspase-3蛋白变化;生物信息学方法寻找miR-1225-5p的靶标基因,并确定CDC14B为潜在靶标。荧光素酶报告基因检测miR-1225-5p与CDC14B 3’ UTR相互作用,qPCR及western blot检测CDC14B在Hep-2细胞及对照骨肉瘤U20S细胞中的表达水平;过表达及干扰miR-1225-5p情况下,qPCR及western blot检测CDC14B mRNA及蛋白表达变化,用于证明miR-1225-5p对CDC14B的调控作用;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染后,观察CDC14B表达水平逆转后,细胞水平恶性表型变化,westem blot检测CDC14B蛋白表达水平变化,MTT检测细胞增殖能力变化,采用流式细胞仪(FC)检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果:人喉癌样本中miR-1225-5p表达水平低于癌旁组织,喉癌细胞中miR-1225-5p表达水平显著低于U20S;miR-1225-5p过表达导致Hep-2细胞增殖能力下降,抑制miR-1225-5p促进Hep-2细胞增殖;miR-1225-5p过表达可提高Hep-2细胞在G0/G1期的比例,降低G2/M期细胞的百分率,反之亦然;Hoechst 33342染色和Annexin V-FITC/PI FC均显示,在过表达miR-1225-5p情况下,Hep-2凋亡细胞数量显著提高;提高miR-1225-5p情况下,Bcl-2表达降低,Bax表达升高,抑制miR-1225-5p,Bcl-2表达升高,Bax表达降低;提高miR-1225-5p情况下,活性caspase3表达升高,抑制miR-1225-5p,活性caspase3表达降低。生物信息学及荧光素酶报告基因分析提示,喉癌细胞Hep-2中,miR-1225-5p与CDC14B 3’UTR区能够结合并调控CDC14B的表达水平,CDC14B可能是喉癌中miR-1225-5p调控细胞恶性表型的潜在靶点;miR-1225-5p过表达及抑制后,Western blot及qPCR实验证实,miR-1225-5p过表达可抑制CDC14B表达水平,而miR-1225-5p干扰可上调CDC14B表达水平;CDC14B干扰载体与miR-1225 inhibitor共转染、CDC14B过表达载体与miR-1225mimic在Hep-2细胞中共转染实验证实,受miR-1225-5p调控的CDC14B表达的改变可以逆转喉癌细胞的增殖、细胞周期改变及细胞凋亡。结论:miR-1225-5p在喉癌标本中表达水平较低,提示miR-1225-5p可能在喉癌的恶性表型中发挥重要作用。增强miR-1225-5p的表达可以使喉癌细胞的增殖和生存受损,导致细胞分裂停滞在G1/S期;相反,抑制miR-1225-5p的表达促进了细胞的增殖及生存。因此miR-1225-5p导致喉癌细胞G1/S期周期阻滞,增加细胞凋亡率。miR-1225-5p可靶向作用于CDC14B 3’ UTR。抑制CDC14B的表达可逆转miR-1225-5p对喉癌细胞的抑制作用。本研究为miR-1225-5p在喉癌发展中的作用提供了直接证据,并初步探讨了 miR-1225-5p在喉癌发展中的机制。